食品微生物檢驗

規范操作基礎培訓

5制片、染色及顯微觀察

福建出入境檢驗檢疫局技術中心食品所微生物實驗室

2010.05

主要內容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養基的制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6實驗室安全基礎知識

5.1顯微操作顯微鏡是微生物檢驗中最常用的精密光學儀器。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗中最常用的是普通光學顯微鏡。顯微鏡的使用方法

用光學顯微鏡觀察微生物形態時，一般遵循先低倍鏡觀察，后高倍鏡觀察，再油鏡觀察。

低倍鏡操作方法1.兩眼從側面注視低倍物鏡對準通光孔，使用粗調焦螺旋將鏡筒自上而下的調節，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當物鏡鏡頭與載物臺的玻片相距2～3mm時停止；2.左眼注視（注意右眼應該同時睜著），并轉動粗調焦螺旋，使鏡筒徐徐上升，直到看清物象為止；3.再用微調焦螺旋調至清晰。

注意：粗調調焦螺旋只用于上調載物臺，如觀察顯微鏡時，用粗調節器調節，有壓碎載玻片、損壞物鏡的危險。因此，用細調焦螺旋調節視野使其更清晰油鏡用后的處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留的油跡；第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。普通顯微鏡的保養

(1)觀察完后，移去觀察的載玻片標本。(2)用過油鏡的，應先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉動物鏡轉換器，放在低倍鏡的位置。(4)將鏡身下降到最低位置，調節好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

§5.2制片和染色

染色原理

由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,必須進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。微生物細胞是由蛋白質、核酸等兩性電解質及其他化合物組成。所以，微生物細胞表現出兩性電解質的性質。兩性電解質兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負電。細菌帶負電荷多，容易與帶正電荷的堿性染料結合，故用堿性染料染色的較多。微生物中細菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。細菌的形態桿菌螺形菌球菌細菌的測量單位：微米(μm)細菌的大小與形態染色方法(一)簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態。(二)復染色法

用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

革蘭氏染色法：不僅能觀察到細菌的形態，而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示。細菌對革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。實驗材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環、載玻片、酒精燈、蠟筆等。2.草酸銨結晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液、石炭酸復紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌實驗內容與步驟(一)細菌的簡單染色步驟

涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

3．固定手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復紅、草酸銨結晶紫或美藍任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。

7．鏡檢(二)細菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察1．取培養物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。5．用蕃紅染液復染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

步驟2：用無菌操作法取少許培養物于蒸餾水滴上

步驟3：用接種環將培養物涂布成一薄層

步驟4：風干

步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定步驟6：結晶紫染色1分鐘

步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

步驟10：番紅復染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

注意事項1．革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。2．選用培養18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實驗成功的關鍵。鞭毛化學組成：鞭毛蛋白功能：運動器官與致病有關鑒定分類細菌莢膜化學組成：多糖或多肽功能：