枯草芽孢桿菌的抑菌機制研究進展

植物疾病是影響農業生產的主要因素之一。然而，世界上對植物疾病的預防和控制主要使用天然藥物。由于長期使用天然藥物，化學藥物會給環境帶來一些嚴重問題，如殘留、污染、有害藥物、損傷和生態平衡，促使人們探索一種新的植物病蟲害防治策略，該策略對人類和環境沒有傷害，并取得了良好的預防效果。利用有益微生物防治植物病害始于1921年Hartely利用真菌防治猝倒病(Pythiumdebaryanumdamping-off)。80多年來植物病害生防微生物已涉及真菌、放線菌、細菌乃至病毒(噬菌體)等種群。目前,應用較多的生防細菌主要有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、土壤放射桿菌(Agrobacteriumradiobacter)等。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜溫性的好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌,能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子,其抑制植物病原菌的范圍很廣,包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害,是一種理想的生防微生物。1枯草芽孢桿菌對其他真菌和細菌病害的抗性枯草芽孢桿菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內,與病原菌競爭植物周圍的營養,分泌抗菌物質以抑制病原菌生長,同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵,從而達到生防的目的。枯草芽孢桿菌主要可以抑制由絲狀真菌等植物病原菌所引起的多種植物病害。現報道的從作物的根際土壤、根表、植株及葉片上分離篩選出的枯草芽孢桿菌菌株對不同作物的眾多真菌和細菌病害具有拮抗作用。如糧食作物中的水稻紋枯病、稻瘟病,小麥紋枯病,豆類根腐病。蔬菜病害中的番茄葉病、枯萎病,黃瓜枯萎病菌、霜霉病,茄子灰霉病和白粉病,辣椒疫病等。枯草芽孢桿菌還可以控制采后水果的多種疫病如蘋果霉心病,柑橘青霉病,油桃褐腐病,草莓灰霉病和白粉病,香蕉枯萎病、冠腐病、炭疽病,蘋果梨青霉病、黑斑病、潰瘍病,金花梨果腐病。此外枯草芽孢桿菌對楊樹潰瘍病、腐爛病、樹黑斑病及炭疽病,茶輪斑病,煙草炭疽病、黑脛病、赤星病菌、根腐病,棉花立枯病、枯萎病等也有較好的防治作用。由于枯草芽孢桿菌具有生長快、營養簡單以及產生耐熱、抗逆芽孢等突出特征,而使其不僅有利于生防菌劑在生產、劑型加工及在環境中的存活、定殖與繁殖,并且批量生產工藝簡單,成本較低,施用方便,儲存期長,因此,枯草芽孢桿菌現已成為一種理想的生防細菌。2干草芽菌能抑制植物病原體的作用枯草芽孢桿菌的生防作用機制多種多樣,概括起來主要有競爭、拮抗、溶菌、誘導植物抗病性和促進植物生長等幾個方面。2.1營養競爭對枯草芽孢桿菌生長的影響競爭作用是生防微生物發揮作用的重要機制之一。枯草芽孢桿菌的競爭作用主要包括營養競爭和空間位點競爭。營養和空間位點的競爭是指存在于同一微小生物環境中的2種或2種以上微生物之間爭奪該環境內的空間、營養、氧氣等現象。營養競爭只在少數菌株中發現。位點競爭指微生物在植物根際、體表或體內及土壤中定殖,大多數枯草芽孢桿菌菌株以位點競爭占優勢。Charles等發現玉米內生枯草芽孢桿菌能在玉米體內迅速定殖和繁殖,并與玉米病原真菌串珠鐮孢菌(FusariummoniliformeSheldon)有相同的生態位,可有效降低該病菌及其毒素(Myeotoxin)的積累。曹君等發現枯草芽孢桿菌BS菌株活菌液對棉花枯萎病的抑菌率在70%以上,而菌株代謝液的抑菌率較低,說明BS菌株對棉花枯萎病的作用機制主要是通過營養競爭的方式。黎起秦等將B47菌株接種到番茄苗上,20d后進行半薄切片,光學顯微鏡檢測,結果表明B47菌株入侵番茄植株后主要定殖在維管束的導管中。2.2枯草芽孢桿菌對抗菌藥物的檢測拮抗作用主要指2種或2種以上的微生物共同生長時,一種微生物在同化作用中產生某種或某幾種特異的次生代謝產物,改變其微環境,從而抑制甚至殺死另一種微生物的現象。同一種拮抗物質可以由多種細菌菌株產生,而同一細菌也可以產生多種不同結構的拮抗物質。1952年首先由Babard等從枯草芽孢桿菌培養液中分離出抗真菌肽,至今從枯草芽孢桿菌不同菌株中已發現60多種拮抗物質,主要有抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類和其它抗菌蛋白及揮發性抗菌物質。其中報道較多的為非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素類及蛋白類抗菌物質。2.2.1iturina和環肽非核糖體途徑合成的環脂肽類抗生素(lipopeptideantibiotic)根據其結構上的差異分為伊枯草菌素(iturin)家族、表面活性素(Surfactin)和豐寧素(fengycinA、B),加上一些結構未知的環肽抗生素如BacillussubtilisTG-26產生的一種新的抗真菌小肽LP1。脂肽類抗生素抗菌作用的原理是其對細胞膜結構特性的影響,通過改變細胞膜通透性抑制病原菌的生長。伊枯草菌素是從一大類小分子環脂肽類物質,包括IturinA、B、C、D、E,芽孢菌素(bacillomyci)D、F、L以及抗霉枯草菌素等。這類物質由1個C14-C17的β-氨基脂肪酸鏈(β-AA)與一個以穩定的手性順序LDDLLDL排列的7肽組成,對大多數的致病酵母和霉菌具有強烈的抗菌能力,其中以IturinA的抗菌活性最強。IturinA存在于大多數的枯草芽孢桿菌中,它的化學結構為一個C14-15-3-氨基-脂肪酸通過羧基和β-氨基與7肽(L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-G1n-L-Pro-D-Asn-L-Ser)末端基團形成內脂,IturinA具有廣譜的抗真菌活性,對于某些種類細菌也有抗菌性。張桂英等通過研究拮抗菌對甘蔗黑穗病菌拮抗作用,發現其抗菌作用機制和IturinA的產生有關。表面活性素(Surfactin)的化學結構為一個C13-15-3-羥基脂肪酸鏈和一個7肽(L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp(Asn)-D-Leu-L-Leu(IleorVa1),通過β-羥基和羧基與肽鏈末端基團形成內脂環狀結構。Surfactin具有潛在的工業應用價值,如洗滌劑制造業、植物病害控制、細胞破碎,是現已發現的一類最強的生物表面活性劑;同時它還具有其他生物活性,如具有抗病毒、抗真菌活性和抗細菌活性。由于Surfactin與化學合成的表面活性劑相比具有毒性低和可生物降解的特點,逐漸受到工業、生物技術和醫療應用方面的關注。豐寧素包括FengyeinA和B。它是由10個氨基酸形成環肽,再連接一個C13-17-β-羥基脂肪酸鏈。環肽結構為L-Gh-D-Orn-D-Try-D-Allo-Thr-L-Glu-D-Ala(Va1)-L-Pro-L-Gin-L-Tyr-L-Ile,6號位置上是D-Ala為FengycinA,若是D-Val則為FengycinB,其中D-Try和L-Ile形成內脂環結構。到目前為止,由于Fengycin難以分離純化,因此對其研究并不廣泛,對其表面活性和抗真菌特性上很少有報道。陳華等從枯草芽孢桿菌JA發酵液中分離出Fengycin,體外抗菌試驗表明Fengycin能夠抑制多種重要植物病原真菌的生長。此外,黃現青等從枯草芽孢桿菌fmbJ中分離出的抗微生物脂肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌具有抑制效果,其抗菌譜較廣。2.2.2枯草芽孢桿菌抗菌基因對植物病原菌的作用從部分拮抗細菌菌株中分離檢測到的蛋白類拮抗物質主要包括一些酶類、抗菌蛋白和多肽類。枯草芽孢桿菌分泌的酶類有幾丁質酶、BacillomycinDsythetaseC(309.104kD)、Putativesensorldnase(53.38kD)、Endo-1-4-b-glucanase(46.60kD)、BacillomycinDsynthetaseB(607.23kD)、Endo-1-b-xylanase(54.26kD)和BacillomyeinDsynthetaseA(448.21kD)等。枯草芽孢桿菌分泌產生的抗菌蛋白對植物病原菌抑制作用機制包括抑制病原菌孢子產生和萌發,使得菌絲畸形,細胞壁溶解,原生質泄露。新抗菌蛋白的獲得將為抗菌基因的克隆和轉抗菌蛋白基因植物的研究奠定理論和試驗基礎。Liu等從B.subtilisB-916中分離到一種新蛋白Bacisubin,分子量為41.9kD。該蛋白具有核糖核酸酶活性和使紅血球凝聚的活性,不具蛋白酶活性和蛋白酶抑制劑活性。Bacisubin對稻瘟病菌(Magnaporthegmee)、菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、甘藍和花揶菜、白菜黑斑病菌(Ahemariabrassicne)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有抑制作用。李晶等從枯草芽孢桿菌B29菌株的發酵上清液分離純化到抗菌蛋白B29I,分子量約為42.3kD,抗菌蛋白B29I可推遲黃瓜枯萎病菌孢子的萌發時間,并可強烈抑制芽管伸長。陳莉等從枯草芽孢桿菌N1729的無細胞濾液經硫酸銨沉淀法獲得的蛋白粗提物對立枯病、枯黃萎病有一定的抑制作用,并且與無細胞濾液拮抗活性比較仍有一定較高的抑制率。邢介帥等研究發現,分離純化的枯草芽孢桿菌T2所產生的蛋白酶對棉花枯萎病菌菌絲生長具有抑制作用,推測可能是蛋白酶降解了枯萎病菌細胞壁中的蛋白質,造成細胞壁缺損,在膨脹壓的作用下菌體發生變形。2.3枯草芽孢桿菌的代謝產物溶菌作用是指拮抗微生物通過吸附在病原真菌的菌絲上,并隨著菌絲生長而生長,產生溶菌物質消解菌絲體,使菌絲發生斷裂、解體、細胞質消解,有的菌絲原生質凝結;或者是次生代謝產物對病原菌孢子的細胞壁產生溶解作用,致使細胞壁產生穿孔、畸形等現象。黃現青等研究發現枯草芽孢桿菌fmbJ產生的代謝物質對點青霉孢子具有溶解作。枯草芽孢桿菌B.916產生的抗菌物質Bacisubin能使Rhizoctoniasolani菌絲頂端腫大、破裂。Chung等從枯草芽孢桿菌ME488的發酵液中檢測出含有溶菌物質Bacilysin,能有效地抑制黃瓜和辣椒的土傳病原體。2.4對病原菌的誘導枯草芽孢桿菌不但能直接抑制植物病原菌,而且能通過誘發植物自身的抗病潛能從而增強植物的抗病性。近年一些研究表明,一些病原菌進入免疫植株的穿入能力因免疫植株抑制其發育、侵入和增殖而明顯降低。經誘導處理的部分植株明顯降低了菌分生孢子萌發和吸器的穿入程度,有的則是菌穿入后植株迅速木質化,并伴隨過氧化物酶活性的增強。趙達等在溫室試驗中發現,用B03發酵液灌根3d后再接種病原菌其發病率和病情指數均顯著低于灌根同時接種和接中3d后灌根2種處理,說明B03能夠有效預防病原菌的侵染。Tang等研究發現,BacillussubtilisB3能誘導小麥過氧化物酶(PO)活性的增加并產生新的PO。李德全等運用離子注入的方法對Bs-916進行誘變,篩選到4株拮抗性比出發菌Bs-916提高15%以上的菌株,并發現拮抗菌Bs-916及其突變菌株分泌活性物質對水稻具有誘導抗性作用,使得水稻植株體內過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)3種酶的活性增強。2.5內生枯草芽孢桿菌在植物根際生活的一類具有刺激植物生長和抑制植物病原菌等綜合作用的細菌群叫促進植物生長根際細菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)。1998年發現生防枯草芽孢桿菌能促進植物根系及植株生長,增強植物的抗病性,從而間接地減少病害發生。蔡學清等對辣椒內生枯草芽孢桿菌Bs-2的研究證明,Bs-2對辣椒苗有明顯的促生作用,同時,該菌株還可誘導辣椒體內吲哚乙酸等促進植物生長的激素含量提高,并降低脫落酸等抑制植物生長激素的形成。張霞等在試驗中發現經生長素和細胞分裂素產量增加的枯草芽孢桿菌B931突變體處理后甘薯苗的發根數和根伸生長都顯著增加。3枯草芽孢桿菌的田間防治效果目前已有很多優良的枯草芽孢桿菌菌株應用于生產實踐。美國Agraquest公司用枯草芽孢桿菌QST713菌株和QST2808菌株分別開發出活菌殺菌劑Serena和SouataAS,已在美國登記使用,葉面施用可防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等細菌和真菌病害。2001年Gustafson將解淀粉枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合制成混合生防藥劑,稱為BioYield。Taensa公司將解淀粉枯草芽孢桿菌變種(B.subtilisvar.amyloliquefaciensFZB24)加工生產為植物促長劑,商品名TaegroTM。施用于溫室或室內栽培樹苗、灌木和裝飾植物根部,可防治由鐮刀菌和絲核菌引起的根腐病和枯萎病。俄羅斯全俄植保所研發的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑Alifine-B,可用于防治多種作物真菌(Fusariun,Rhizoctonia,Ascohyta,Colletotrichum,Sclerotinia,Botrytis)病害,田間防效高達60%-95%,增產達25%-35%;韓國Bio公司將枯草芽孢桿菌與鏈霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物殺菌劑Mildewcide,葉面噴施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病,也可防治花卉、水果和水稻真菌病害。國內對具有生防作用的枯草芽孢桿菌的研究涉及的防治對象有大田作物的葉部病害、土傳病害和果實病害等。2002年顧真榮等用枯草芽孢桿菌G3防治菜豆和茄子苗期炭疽病和菌核病,防效分別為35.4%和64.1%,對番茄葉霉病防效為78.8%。紀明山等研究表明,用芽孢桿菌B67菌株對西瓜枯萎病的防效80%以上。我國臺灣的研究人員從土壤中分離出對尖鐮孢有抗性的枯草芽孢桿菌菌株W1l3和W1l8,并從其幾丁質中提取出高度耐熱的殺菌劑,發現在100℃高溫30min仍有活性。易有金等從煙草青枯病(菌)流行區的健康煙草植株莖內分離到l株內生枯草芽孢桿菌拮抗菌B–001,2003年在湖南省郴州、2004年在湖南省寧鄉利用該菌株進行田間防治試驗,防效分別為82.5%,65.2%。國內已開發成功并投入生產的枯草芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、依天得、根腐消等。云南農業大學和中國農業大學共同研制的微生物農藥“百抗”全國