高效液相色譜法測定豬組織中替米考星的殘留

近年來，我國產品污染、有毒有害物質殘留的問題十分嚴重。然而，動物福利品食品中的藥物殘留是最重要和最常見的污染物。獸藥殘留不僅直接影響人體健康,引起細菌耐藥性增加,給生態環境帶來不良影響,它還可通過環境和食物鏈作用對人體健康造成潛在危害,從而影響養殖業的發展,并成為我國動物性食品出口的主要制約因素。替米考星是泰樂菌素經酸水解后的衍生物,是半合成的大環內酯類抗生素。替米考星的殘留在豬、羊體內肝、腎中殘留較高,而肌肉、脂肪、皮膚中殘留較低,其原形為主要殘留物,糞便中也存在微量。而磷酸替米考星是替米考星與3,5-二甲基哌啶反應生成的替米考星堿,再加磷酸和水后形成的。盡管其有效成分仍然為替米考星,但由于磷酸替米考星易溶于水,具有特殊的抗菌活性和藥動學特征,所以在獸醫臨床上可廣泛應用于預防和治療動物的感染性疾病。盡管有關磷酸替米考星在動物組織中殘留消除的研究報道并不鮮見,但改變劑型的磷酸替米考星可溶性粉在豬組織中的殘留情況仍然需要進一步研究和明確。根據農業部《獸藥殘留試驗技術規范(試行)》的要求,在建立豬組織中檢測替米考星的高效液相色譜(HPLC)方法的基礎上,對磷酸替米考星在豬體內的殘留消除進行了解,以便使用該藥防治豬的相關性疾病。本試驗利用高效液相色譜(HPLC)技術,檢測磷酸替米考星在豬肌肉、肝臟、腎臟、皮膚和脂肪等組織中的殘留,并依其制訂磷酸替米考星在豬體內安全合理的藥物休藥期,旨在為磷酸替米考星作為新獸藥應用于獸醫臨床提供依據。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1單籠飼養試驗44頭健康姜曲海品種豬,購自江蘇泰州姜曲海種豬場,體重約(25±2)kg,飼養于封閉的動物房中,雌雄各半,單籠飼養,試驗開始前及試驗過程中飼喂不含任何抗生素的全價飼料,每天定時給料2次。試驗前先給豬打耳標,逐頭稱重并記錄,并且連續飼喂3周以適應養殖環境。1.1.2試劑和儀器替米考星對照品(批號:k0310711,含量91.0%)購自中國獸藥監察所;10%磷酸替米考星可溶性粉(批號:20110401,標示量為94.0%)由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供;磷酸(分析純)、乙酸銨(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;甲醇(色譜純)購自江蘇漢邦科技公司;四氫呋喃(色譜純)購自美國TEDIA天地試劑公司;二丁胺(化學純)購自江蘇強盛功能化學股份有限公司。1.1.3固相萃取柱、萃取儀器和實驗儀器高效液相色譜儀(LC-2010)為日本島津公司產品;XTerra?RP18色譜柱(4.6mm×50mm,5μm)為美國Waters公司產品;BondElutC18固相萃取柱(500mg/6mL)為美國Agilent公司產品;組織勻漿機(F8-8G)為德國弗魯克公司產品;臺式離心機(LD4-2A)為北京京立離心機有限公司產品;漩渦混合儀(WH-2)為上海滬西分析儀器廠有限公司產品;微量分析天平(FA1004N,精確度0.0001g)為德國莎多利斯公司產品;pH計(pH221)為意大利哈納HANNA公司產品;固相萃取真空管裝置為天津市東康科技有限公司產品;溶劑過濾器為天津市奧特塞恩斯儀器有限公司產品;針筒式微孔濾膜過濾器(0.22μm)為江蘇漢邦科技公司產品。1.1.4%磷酸混合二丁胺溶液將100mL磷酸(85%)慢慢地加到900mL水中,邊加邊攪拌,再用水定容到1000mL。將10%磷酸溶液700mL邊加邊攪拌,加到168mL二丁胺中。待溶液冷卻至室溫后,用85%磷酸調至pH2.5,加水定容至1000mL,配制成1mol/L二丁胺磷酸緩沖液(貯備液)。該溶液穩定,但溶液變成棕色則不能使用。1.2豬的停藥方案試驗開始時,將44頭受試豬隨機分為空白對照組(4頭)和試驗組(40頭)。試驗組受試豬均采用磷酸替米考星推薦劑量80mg/L飲水投藥,自由飲水,連續給藥7d。投藥后,分別在豬停藥后的0.5、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、14.0、16.0和19.0d(共10個檢測點),隨機于每個檢測點選擇4頭試驗豬進行屠宰。宰殺之前稱重,將豬經頸靜脈放血致死,快速取其肌肉(300～500g)、肝臟(400～500g)、脂肪和皮膚(200g),雙腎各取一半(縱切)。采集的樣本不作任何洗滌或處理,立即做好標記、包裝,保存于-20℃冰箱,待測。1.3試驗和處理條件1.3.1流動相乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺緩沖液檢測波長280nm;流速1mL/min;柱溫35℃;進樣量10μL,由自動進樣器進樣;流動相:乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺緩沖液(pH2.5)-超純水(體積比為100∶50∶50∶800);XTerra?RP18色譜柱(4.6mm×50mm,5μm)。1.3.2流動相和定溶液根據文獻報道,配制流動相1,同時按照替米考星檢測的國家標準配制流動相2。固相萃取吹干后復溶的定溶液也分別用流動相和稀釋液,進行交叉試驗確定最佳的流動相和定溶液。流動相1:V(乙腈)∶V(四氫呋喃)∶V(二丁胺磷酸鹽緩沖液)∶V(水)=10∶5∶5∶80,以10%磷酸溶液調節,流動相調節為pH2.5。流動相2:V(乙腈)∶V(四氫呋喃)∶V(二丁胺磷酸鹽緩沖液)∶V(水)=130∶55∶25∶790,以10%磷酸溶液調節,流動相調節為pH2.5。替米考星標準液1為流動相定容;替米考星標準液2為稀釋液定容。1.3.3標準曲線的繪制用流動相將替米考星標準貯備液(200μg/mL、乙腈定容)稀釋成0.05、0.50、1.00、5.00、10.00和25.00μg/mL的標準工作溶液,以其質量濃度為橫坐標,峰面積(順式和反式異構體的峰面積之和)為縱坐標,繪制標準曲線。1.3.4spe柱的制備將凍存于-20℃冰箱中的待檢組織(肝、腎、肉、脂肪和皮膚等)解凍,剪碎組織,于勻漿器中15000r/min勻漿3min。分別準確稱取待檢組織各5.0g,置于50mL聚丙烯離心管中,加8mL乙腈,渦動混勻。中速振蕩20min,3500r/min離心10min,取上清液置于100mL聚丙烯離心管,向組織凝塊中分別加5mL磷酸二氫鉀緩沖液(0.1mol/L,pH2.5)和8mL乙腈,攪拌使組織凝塊散開,渦動混勻,中速振蕩20min,3500r/min離心10min,合并2次上清液于100mL聚丙烯離心管中,加40mL水,3500r/min離心10min,取上清液于適當容器中,加10mL水混勻,過SPE柱。將SPE柱置于固相萃取真空管裝置上,10mL甲醇活化和10mL水平衡SPE柱,當樣品通過SPE柱時,調整真空泵的壓力使流速約1滴/s,10mL水洗滌,再用10mL乙腈洗滌,流速1滴/s,乙腈從SPE柱流出后,將真空泵的壓力調小,讓SPE柱在真空下干燥至少3min,2.5mL洗脫液(0.1mol/L乙酸銨甲醇-乙腈溶液(體積比為20∶80)洗脫。洗脫于刻度試管中,30℃水浴中氮氣吹至近干。流動相稀釋定容至1mL,渦動30s,放置15min,0.22μm針孔式濾膜過濾,取10μL進HPLC分析。1.3.5檢測限和定量限取空白的肝臟、腎臟、肌肉、皮膚和脂肪樣品添加標樣,采用倍比稀釋,按上述樣品前處理的方法進行處理,測得基線噪音值,按信噪比S/N=3為檢測限(LOD),S/N=10為定量限(LOQ)。1.3.6標準溶液的配制分別取空白肌肉5.0g、肝臟5.0g、腎臟5.0g、脂肪和皮膚5.0g,按照要求添加一定體積的標準溶液,使肝、腎中藥物的質量分數為0.05、0.50和5.00μg/g;肌肉、脂肪和皮膚中藥物的質量分數為0.02、0.20和2.00μg/g,每個質量分數設定3個平行,按上述樣品前處理方法分別處理后進行HPLC測定,雙針進樣,分別測定,計算回收率和變異系數。1.3.7提取劑5.1%、l計算公式為式中:S為替米考星的峰面積(順式和反式異構體的峰面積之和);B為標準曲線的截距;K為標準曲線的斜率;V為提取樣品最終定容的體積,mL;m為樣品的質量,g;F為濃縮(稀釋)因子。2結果2.1色譜峰峰時間在本試驗色譜條件下,替米考星與組織中其他組分分離良好,色譜峰峰形較佳,測得的替米考星反式異構體和順勢異構體的出峰時間在10.8和13.0min左右(圖1)。2.2標準曲線的繪制各取0.05～25μg/mL的標準工作溶液10μL,進HPLC分析,以溶液質量濃度為橫坐標,峰面積(順式和反式異構體的峰面積之和)為縱坐標,繪制標準曲線(圖2)。得知y=14192x-1035,R2=0.9998,說明替米考星濃度和峰面積呈完全正相關。2.3檢測限和定量限按信噪比S/N=3為LOD,S/N=10為LOQ,求得豬肝臟和腎臟中替米考星的檢測限為0.025μg/g,定量限為0.05μg/g;肌肉、脂肪和皮膚中替米考星的檢測限為0.01μg/g,定量限為0.02μg/g。2.4藥物提取的總體回收率,見表1由表1可知,在0.05、0.50和5.00μg/g時,從肝臟中藥物提取的平均回收率分別為97.82%、81.81%和88.67%,變異系數為3.72%～8.17%;從腎臟中藥物提取的平均回收率分別為92.82%、92.87%和90.24%,變異系數為1.05%～10.5%。在0.02、0.20和2.00μg/g時,從肌肉中藥物提取的平均回收率分別為96.09%、89.64%和77.56%,變異系數為2.34%～8.99%;從脂肪和皮膚中藥物提取的平均回收率分別為91.57%、96.21%和81.15%,變異系數為0.78%～8.87%。由此可知,該組織前處理方法和檢測方法均可靠,重復性好。2.5組織中替米考星的殘留將在不同時間點剖殺受試豬后所采取的肝臟、腎臟、肌肉和脂肪進行處理以后,上機檢測,外標法定量測定各個組織中替米考星的含量,所得結果如表2、表3。從表2可以看出,10%磷酸替米考星可溶性粉的代謝物替米考星在肝臟和腎臟中的含量較高,在肌肉、皮膚和脂肪中的含量較低。豬按推薦劑量連續用藥7d后,各組織中殘留消除速度不同,其中以在肝臟和腎臟中的下降速度快,而肌肉、脂肪和皮膚組織中的殘留量原本就已經很低,因此下降趨勢相對平緩,但也都呈現出明顯的下降趨勢。從圖3可以看出,從停藥開始到停藥后19d,受試豬各種組織中替米考星的殘留量逐漸降低。10%磷酸替米考星可溶性粉停藥后3d,替米考星在受試豬肝臟和腎臟中的殘留分別為0.852和0.518μg/g,已經低于國家規定的最高殘留限量;而豬肌肉組織中替米考星的殘留在停藥后第5天為0.076μg/g,低于國家規定的最高殘留限量;皮膚和脂肪組織中替米考星的殘留為0.052μg/g,在停藥后的第11天也低于國家規定的最高殘留限量。將試驗所測得組織藥物濃度-時間數據用WT1.4軟件進行處理,如表3所示豬肝臟的休藥期(WDT)為5.73d,腎臟的WDT為3.75d,肌肉的WDT為11.57d,皮膚和脂肪的WDT為10.91d。根據農業部最高殘留限量標準,按雙單側95%置信區間計算替米考星在豬的休藥期為12d。3討論3.1流動相及色譜峰的確定本試驗所采取的色譜條件是在國家標準(農業部1025號公告-10-2008動物性食品中替米考星殘留檢測高效液相色譜法)的色譜條件基礎上,以乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺磷酸緩沖液-超純水(體積比130∶55∶25∶790)作為流動相。經過反復試驗,將其流動相比例修正為乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺緩沖液(pH2.5)-超純水(體積比100∶50∶50∶800)。結果顯示,替米考星的出峰時間及峰形都達到最佳,響應值高,替米考星與其他組分的分離良好,色譜峰峰形較佳。在進行磷酸替米考星檢測中還發現,選用1mL流動相比選用1mL酸稀釋液定容呈現出分離度更好的色譜峰,峰形更尖銳。另外,結合相關文獻記載的方法,凈化選用BondElutC18固相萃取柱(500mg/6mL),回收率結果和空白添加色譜圖均說明該固相萃取柱具有良好的凈化和保留效果。3.2受試豬組織的提取豬的各種組織成分復雜,對替米考星的檢測效果會造成不同程度的干擾,因此客觀上需要對樣品進行前處理。根據國家標準及相關文獻的前處理方法,將受試豬組織進行勻漿后,用乙腈和磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH2.5)分二次進行提取,以確保提取充分,并用水調節其極性。提取液再用固相萃取柱進行凈化、氮氣吹干、定容和上樣。結果證實,組織樣品前處理方法進行改良后,該方法分離藥物的效果明顯提高,能將大部分雜質去除,準確度高,回收率達到要求,具有良好的準確性和重現性。3.3投服磷酸替米考星在不同組織中的殘留按照資料所顯示的獸藥殘留標準,替米考星在豬肝臟、腎臟、肌肉、脂肪和皮膚中的最高殘留量(MRL)分別為1.0、1.0、0.10和0.10μg/g。從本試驗結果可以看出,10%磷酸替米考星可溶性粉在豬組織中的殘留消除規律以在肝臟和腎臟中的殘留濃度最高,肌肉、皮膚和脂肪組織中的殘留較低,這與文獻中報道的替米考星的殘留結果相一致。投服磷酸替米考星7d后,肝臟、腎臟中替米考星的殘留在停藥后第3天即低于國家最高限量1000μg/kg,而在肌肉、脂肪和皮膚中的殘留量在投藥后的5和13d后低于國家最高殘留限量100μg/kg,而且