泛素在真核生物中的應用

蛋白質在生命過程中起著重要作用，如細胞信息的傳輸、物質代謝和身體防御。目前，它在促進泛素-蛋白酶原過程中能夠分解出蛋白質。但近年來發現有些蛋白質(例如組蛋白)在被泛素化修飾后并不能使蛋白質降解。本文僅就組蛋白的泛素化、去泛素化以及與乙酰化、甲基化磷酸化之間的關系作一簡單介紹。1蛋白質的多泛素化修飾泛素(ubiquitin,Ub)是高度保守的、含76個氨基酸的蛋白質,分子量為8.5kDa,在真核生物體內廣泛存在。泛素分子氨基端1~72位點的氨基酸殘基形成一個緊密折疊的球狀結構,緊靠羧基端的4個氨基酸殘基是隨機盤繞的。蛋白質的泛素化修飾就是蛋白質的賴氨酸殘基位點與泛素分子的羧基末端相互結合的過程。由于泛素分子本身有7個賴氨酸殘基位點,并且泛素本身的賴氨酸殘基也可以與泛素分子相互結合,因此底物蛋白的一個賴氨酸殘基可能結合多個泛素分子,這樣就形成了蛋白質的多泛素化修飾。蛋白質的多泛素化鏈中,泛素羧基末端76位點的甘氨酸殘基通常與前一個泛素分子的48、63、29或11位點的賴氨酸殘基結合[2~4]。48位點的賴氨酸殘基表面有連續的疏水片段,這個片斷是結合蛋白水解酶所必須的,也是底物被泛素化修飾后降解所必須的。當泛素的賴氨酸殘基連接4個或者超過4個泛素標簽時,則底物蛋白就可能通過26S蛋白酶作用而降解。蛋白質還可以被單泛素化修飾。單泛素化修飾就是底物蛋白的一個或幾個賴氨酸殘基僅結合一個泛素分子。單泛素化可能影響底物局部的三維空間結構。蛋白質的單泛素化修飾是可逆轉的、非蛋白質水解的調控,可以調控如內吞作用、組蛋白的活性、DNA修復等過程。真核細胞中泛素化修飾后的靶蛋白可能被降解﹑可能被轉移到細胞內或細胞外的特定部位,也有可能導致靶蛋白的功能發生變化,這主要取決于靶蛋白所加的泛素鏈的結構,以及泛素鏈的長短。2沒有發現的統整體的泛素化泛素化調節途徑共有三類酶催化:泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1),泛素接合酶(ubiquitinconjugatingenzyme,E2),泛素-蛋白質連接酶(ubiquitinproteinligase,E3)。首先,由泛素激活酶催化,泛素的羧基末端與泛素激活酶的半胱氨酸激活位點以巰酯鍵(thiolesterbond)結合,此過程需要消耗ATP。第二步,泛素被轉運到泛素接合酶的半胱氨酸殘基,也是以巰酯鍵的形式接合;接合酶共有超過20個這樣的半胱氨酸殘基激活位點。最后,在泛素連接酶的作用下,通過泛素的羧基末端與底物蛋白的賴氨酸ε-氨基基團之間形成肽鍵(isopeptide)而將泛素轉移到底物蛋白上。E3對靶蛋白的特異性識別在泛素調節路徑中起決定作用。多聚泛素化需要以上三種酶的共同作用,而單泛素化一般僅需要前兩種酶。迄今為止,發現并且鑒定的E3主要有兩大類:HECT(homologoustotheE6-APcarboxylterminus)結構域家族和RING(reallyinterestingnewgene)結構域家族。HECT結構域主要是通過與泛素形成催化作用所必需的硫酯鍵發揮作用,而RING結構域為E2和底物提供居留位點從而使E2催化泛素轉移到底物上。像乙酰化和磷酸化一樣,組蛋白泛素化是可逆轉的調控。因此,組蛋白泛素化的動態平衡過程由兩個因素決定:細胞內可以利用的游離泛素和可以對組蛋白添加或移除泛素的酶的活性。將泛素加到組蛋白需要一系列酶E1、E2、E3的作用。泛素部分的移除需要肽酶(isopeptide)的活性。雖然所有蛋白質的泛素化修飾使用相同的E1和不同的E2,但是不同蛋白質的泛素化似乎需要特異性的E3。兩個芽殖酵母蛋白Rad6、Cdc34,在體外已經顯示在沒有E3的存在下,能夠泛素化組蛋白H2B。然而,體內研究發現僅Rad6是H2B泛素化所必須的。近來的研究顯示Rad6相關的RING蛋白Brel可能是H2B泛素化的E3,因為RING結構域的Brel突變在體內取消了H2B的泛素化。研究還證明Rad6和Brel在進化中是保守的。相對于酵母的Rad6,HR6A和HR6B是在哺乳動物體內的兩個同源物。實驗表明HR6A和HR6B在體內能夠部分的彌補酵母的Rad6突變,在體外能夠泛素化組蛋白H2B。在人類也發現了Brel兩個推定的同源盒。與H2B泛素化的情形不同,生物體內并未發現H2A泛素化的E2、E3。體外研究發現純化的Rad能夠泛素化H2A、H2B。但是,還不清楚H2A和H2B在體內是否擁有相同的E2。酵母中檢測不到H2A的泛素化,這阻礙了對E2、E3的研究。小鼠精子發生過程中uH2A的分析揭示了HR6B與uH2A有強烈的關聯。然而,在HR6B剔除小鼠體內未檢測到uH2A。這個結果盡管可以解釋為HR6A和HR6B之間可能有功能上的重復,但是也說明HR6B在H2A泛素化過程中可能沒有功能。考慮到在哺乳動物體內還有兩個推定的Brel同源盒,HR6A和HR6B這兩個蛋白質中是否有一個在體內有E3的功能可能需要進一步研究。3組蛋白hb作為基因組織的調控作用染色質是一系列核小體相互連接成的念珠狀結構。核小體的核心是由組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩個分子構成的八聚體,在八聚體的表面纏繞有1.75圈的雙螺旋DNA。相鄰的兩個核小體之間由DNA連接,稱為纖絲(fiber),在纖絲部位結合有組蛋白分子H1。在組蛋白H1存在時,核小體之間緊密接觸,形成直徑為10nm的纖維狀結構。這就是染色體構型變化的一級結構。在染色質中,DNA和組蛋白是染色質的穩定成分,組蛋白與DNA的含量之比接近1∶1。組蛋白是染色質的主要蛋白質成分,通過帶正電荷的氨基末端區域與帶負電荷的DNA骨架相互作用,對基因的表達有重要調控作用。目前研究發現,組蛋白除了可以被乙酰化、甲基化、磷酸化等修飾以外,還能被泛素化修飾。組蛋白H2A在1975年被首次發現有泛素化修飾,其泛素化修飾位點是高度保守的賴氨酸殘基119(K119)位點。研究發現在大量高等真核生物中H2A總量的5%~15%被泛素化,除了在芽殖酵母中沒有發現泛素化的組蛋白H2A(ubiquitinated-H2A,uH2A)以外,在許多組織和細胞中都發現有多聚泛素化(polyubiquitination)的H2A。研究還發現,組蛋白H2A的泛素化能夠促進組蛋白H1與核小體的結合,促進多聚梳群蛋白(polycombgroupprotein)的沉默,還在X染色體失活的起始過程中有重要作用。除了H2A以外,組蛋白H2B也可以被泛素化修飾。盡管染色質中泛素化的組蛋白H2B量并不多,約占1%~2%,但是在從芽殖酵母到人類的真核生物中廣泛分布。H2B的泛素化位點也定位于羧基端的賴氨酸殘基:哺乳動物的賴氨酸120(K120)位點,芽殖酵母K123位點。對芽殖酵母S.cerevisiae的研究發現,組蛋白H3的4位賴氨酸的二甲基化或三甲基化需要H2B的123位賴氨酸的泛素化,說明一個組蛋白亞單位的修飾能夠調控另一個不同亞單位的修飾;研究還發現H3的4位賴氨酸的甲基化能夠導致端粒附近基因的沉默,因此H2B的甲基化能夠間接調控基因的沉默。Robzyk等研究發現,H2B的123位賴氨酸泛素化位點的突變能夠影響有絲分裂細胞的生長和減數分裂。在對人類乳腺癌細胞的研究發現:組蛋白H2B在染色質中的水平與正在進行的轉錄有關,特別是依賴于核不均RNA(hnRNA)的合成。當核小體在轉錄過程中開放時,組蛋白H2B會被泛素化,并阻止核小體的重新折疊,以促進下一輪的轉錄。此外,研究還發現泛素化的組蛋白H2B優先富集于染色質的轉錄激活區域,組蛋白H2B的泛素化還與聚合酶的延伸有關,以上可以推測組蛋白H2B的泛素化能夠促進基因的轉錄。研究還發現H2B的123位賴氨酸的泛素化還能影響H3的79位賴氨酸的甲基化。Ng等報道H2B的123位賴氨酸和H3的79位賴氨酸在核小體內的空間位置非常靠近,H2B的123位賴氨酸的泛素化對H3的79位賴氨酸的甲基化很重要,但反過來H3的79位賴氨酸的甲基化對H2B的123位賴氨酸的泛素化卻沒有影響。綜上所述,組蛋白H2B的泛素化修飾對基因的表達有調控作用。Henry等通過對GAL1基因表達的研究,提出了一個組蛋白H2B泛素化調控基因轉錄的模型:GAL1基因的正常轉錄需要組蛋白H2B的泛素化和去泛素化修飾,并且泛素化過程非常短暫。首先組蛋白H2B發生泛素化修飾,H2B的泛素化修飾導致了H3的4位賴氨酸的甲基化;緊接著H2B發生去泛素化,這又誘使H3的36位賴氨酸甲基化,此時GAL1基因能夠正常轉錄。如果組蛋白H2B未發生泛素化,則H3的4位賴氨酸不會甲基化,此時H3的36位賴氨酸高甲基化,從而基因低水平轉錄。但是如果組蛋白H2B雖然發生了泛素化修飾,而隨后沒有去泛素化修飾,則H3的4位賴氨酸高甲基化、H3的36位賴氨酸低甲基化,此時基因仍然只能低水平轉錄。由此可見H2B去泛素化能夠促進H3的4位賴氨酸和H3的36位賴氨酸之間的甲基化平衡,從而調控GAL1基因的正常轉錄。泛素化形式的H3不多,僅在大鼠睪丸變態的精子細胞中有發現。在對果蠅體外實驗的研究發現:真核生物基因轉錄所必須的通用轉錄因子TFIID的成分TAFII250,能夠參與組蛋白H1泛素化激活、共軛接合,這也是首次報道同一個蛋白質內有E1、E2兩種酶的活性。相比較而言,組蛋白H3、H1的泛素化形式比H2A、H2B少,目前也還沒有發現組蛋白H3、H1的泛素化位點。另外,核心組蛋白的變異體也發現有泛素化修飾。如巨大組蛋白H2A1.2(macroH2A1.2)的K115、K116位點等都發現有泛素化修飾。泛素化的macroH2A可以招募組蛋白H1到核小體以使染色質進一步壓縮,并且在雌性哺乳動物的X染色體失活過程中,組蛋白H2A和macroH2A的泛素化可能有協同作用。各種組蛋白的泛素化修飾見表1。4ubp1細胞中心蛋白及ubp8催化的去泛素化酶泛素部分可以通過泛素76位點甘氨酸的肽鍵水解而移除。目前發現至少有90種去泛素化酶,并且這些酶有序列多樣性。由于細胞內泛素不是游離的單體,而是以多聚泛素蛋白和泛素核糖體融合蛋白的形式存在,因此去泛素化酶是從多聚泛素鏈、泛素前體物質和泛素綴合物中生成泛素單體的關鍵。去泛素化酶分為兩個家族:泛素羧基端水解酶家族(UbC-terminalhydrolase,UCH)和泛素特異性加工蛋白酶家族(Ub-specificprocessingprotease,UBP)。泛素羧基端水解酶家族分子量一般較小(除了BAP1,81kDa),約20~30kDa,并且有組織特異性。UCH家族的核心催化域與已知的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶非常相似,有230個氨基酸核心催化域,能夠水解泛素羧基端的酰胺基和酯鍵。UBP的核心催化域有350個氨基酸。芽殖酵母有16種UBP,分子量從50~250kDa不等。這些UBP間的不同在于其不同的氨基端延伸物,這些氨基端延伸物能夠識別底物特異性。第一個被分離出的UBP是Ubp4。Ubp4的突變導致酵母MATα2因子的降解缺陷,并且Ubp4負責將多聚泛素肽鏈從底物上移除。另外,研究顯示Ubp3與Sir4(與異染色質沉默有關)有關,但是目前還不清楚這個泛素蛋白酶的底物。有研究發現Ubp8的突變(SAGA復合物的成分)會導致uH2B的增加。此外,野生酵母純化的SAGA復合物能夠在體外去泛素化H2B,而源自Ubp8缺失酵母的SAGA復合物卻沒有這種功能。Ubp3突變體未發現有這樣的效果,因而Ubp8對uH2B的影響可能是特異性的。在對芽殖酵母的研究發現,H2B的泛素化是可逆轉的過程,泛素的移除是被Ubp8催化的。但是令人不解的是,在SAGA復合物中有兩種組蛋白修飾活性(去泛素化和乙酰化)。研究發現,Ubp8作為組蛋白H2B的去泛素化酶,能夠被招募到GAL10基因的上游激活序列,是GAL10基因表達所必須的。由于Ubp8的同源物存在于從植物到人類的大量的生物體內,因此Ubp8同源物是否參與H2A的去泛素化還有待研究。研究證實組蛋白的去泛素化與染色質的凝集有關。組蛋白在有絲分裂間期是泛素化的,但在有絲分裂中期組蛋白被去泛素化,此時染色質凝集成染色體。到有絲分裂后期染色體解聚成染色質時,組蛋白又被重新泛素化。在哺乳動物細胞中分離出一種去泛素化酶UbpM,發現UbpM也參與染色質的凝集,突變后能夠阻滯細胞分裂。另外,組蛋白去泛素化酶Ubp10還能夠使組蛋白去泛素化而維持端粒的長度和穩定性。Mimnaugh等也發現組蛋白H2A的去泛素化與核固縮和染色質凝集密切相關,并且認為這些信號是細胞凋亡的前兆。5基因組蛋白修飾的基因表達泛素化和磷酸化有幾個共同的特征:(1)二者都是可逆的共價結合修飾。磷酸化能被蛋白磷酸酶逆轉;泛素化也能被肽酶或去泛素化酶逆轉。(2)反應迅速。兩種修飾反應都能在幾分鐘或幾秒鐘內快速發生。(3)泛素化和磷酸化都是高度特異性的,并且被一系列不同的酶控制。人類基因組計劃證明有超過40種不同的E2、500種不同的E3、80種不同的去泛素化酶。研究還顯示人類有蛋白激酶518種、磷酸化酶120種。(4)泛素化和磷酸化都能通過結合特異性氨基酸的結構域檢測。近年來的研究發現,組蛋白的乙酰化能夠破壞核小體核心顆粒的穩定性。另外,H2A、H2B的泛素化能夠減弱染色質中H2A-H2B二聚體與H3-H4四聚體之間的相互作用。在精子發生過程中,如果轉錄起始和延伸確實需要H2A-H2B二