氮磷比對小球藻生長的影響

小麥粉含量約62.5%。氨基酸含量豐富，種類全面，包括18種氨基酸，占魚粉和酒精的總含量的接近魚粉和糖母。這是植物的優良蛋白質來源。小球藻粗纖維含量低,礦物質和維生素含量較高,同時含有豐富的類胡蘿卜素和葉綠素,在促進畜禽生長,改善產品品質方面都有良好的作用。氮、磷類營養鹽是影響小球藻生長的最主要因子,藻類繁殖程度主要取決于水體中這兩種成分的含量(吳國琳,2004)。目前對微藻的研究中,一般使用磷酸二氫鈉(NaH2PO4)或磷酸二氫鉀(KH2PO4)作為磷(P)源,而氮(N)源的使用比較廣泛,但主要集中在硝酸鹽、尿素等非銨態氮(沈頌東,2003a,b),而對于碳酸氫銨等銨態氮的報道很少。另外,碳酸氫銨由于市場價格遠低于尿素等化肥,在農業生產上已經獲得了大規模的應用。本文研究了碳酸氫銨(NH4HCO3)作為氮源對小球藻生長的影響,為NH4HCO3在小球藻的大規模生產及應用提供理論依據,也為提高小球藻生產探索一種經濟有效的方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1藻類藻類1.1.2試驗購買海水晶配制人工海水,比重為1.022。采用F/2培養液(Guillard,1975),N源和P源按本試驗設計添加,試驗用試劑和藥品均為分析純。1.2方法1.2.1最優條件選擇和n、p濃度組合試驗共9個處理組,每組分別添加N質量濃度為0、50、100mg/L的NH4HCO3和P濃度為0、3、6mg/L的NaH2PO4,進行3×3雙因子試驗,即:N0P0、N0P3、N0P6、N50P0、N50P3、N50P6、N100P0、N100P3、N100P6組。通過對生物量、生長速率和葉綠素等生長指標的分析,初步篩選出對小球藻生長效果較好的N、P濃度組合。然后縮小濃度梯度,進一步確定最佳的N、P濃度組合。每組均設3個平行。1.2.2l錐形瓶培養模式把擴培到一定濃度的藻種棄去原培養液,按比例1∶4接種到250mL錐形瓶中,在智能光照培養箱內培養8~9d。培養溫度為(25±1)℃,pH為(7.2±0.1),光照強度為(5000±100)lx,光暗周期比為14h∶10h,靜態培養,每天定時搖3次。1.3測量指標和方法1.3.1外周血計數測試吸光度(OD)值:掃描小球藻的最大吸收波長為570nm,每天定時取少量藻液測定其光密度值。細胞密度:定時取0.2mL藻液,加4mL蒸餾水稀釋搖勻,用血細胞計數板在光學顯微鏡(400倍)下計數。每個樣計2次重復,取平均值。細胞數(個/mL)=任何兩個對角大格的細胞總數/2×104×稀釋倍數。干重:隔天定時取2mL藻液經離心后,藻沉淀轉移至已稱重的鋁盒內,置烘箱內于105℃烘干至恒重,轉到干燥器30min,然后稱重,計算與鋁盒重量的差值。1.3.2超聲波細胞破碎法定時取2mL藻液于離心管中,4000r/min離心5min,棄上清夜,加入3mL80%丙酮,用超聲波細胞破碎儀破碎藻細胞,然后分別在645nm和663nm處測吸光度(Becker,1994)。計算公式為:葉綠素濃度(mg/L)=(20.2×OD645+8.02×OD663)×稀釋倍數。2結果與分析2.1n-p組和小球藻生長2.1.1小球藻生長抑制率由圖1和圖2可以看出,添加N為50、100mg/L時小球藻的OD值和細胞密度都明顯大于N為0mg/L時,而N為100mg/L相對N為50mg/L添加組有所下降,說明N為100mg/L對小球藻的生長產生了抑制作用。圖1中,各處理組在第7天小球藻的OD值達到最大值,其中N50mg/L、P3mg/L處理組最大達到0.616。圖2中,各處理組在第4~5天小球藻的密度達到最大值,其中N50mg/L、P3mg/L處理組小球藻密度值最大達到138.0×105個/mL。2.1.2葉綠素含量的變化規律添加N50、100mg/L時小球藻的單位體積葉綠素含量大于N0mg/L時,N50mg/L的效果較N100mg/L好,其中N50mg/L、P3mg/L添加組最明顯。各組的葉綠素含量在第7天達到最大值,之后呈下降趨勢,與OD值的變化規律基本上一致,其中N50mg/L、P3mg/L最大為17.902mg/L。N對應的各組P濃度均以3mg/L為佳,6mg/L時則對小球藻生長產生抑制作用,結果也與OD值和細胞密度反應的規律呈一致。通過相關性分析,葉綠素的增量與OD值的回歸方程為y=0.0255x+0.0555,R2=0.9939(x為葉綠素增量,y為OD值),說明葉綠素的變化規律與生物量的變化有著密切的聯系。綜上可以得出,N濃度為50mg/L、P濃度為3mg/L對小球藻的促生長效果較好。2.2設計n濃度范圍根據上述試驗結果,進一步縮小N、P的濃度范圍,設計N濃度為40、50、60mg/L的碳酸氫銨和P濃度2、3、4mg/L的磷酸二氫鈉進行雙因素試驗。2.2.1不同處理組小球藻生長指標的相關性分析由表2得出,添加N40mg/L時小球藻的OD值和細胞密度比N50mg/L和60mg/L時低。而N60mg/L時細胞密度低于N50mg/L,而OD值在第6天前也顯著低于N50mg/L,之后兩者不顯著,將細胞密度與對應OD值進行相關性分析,得回歸方程y=234.89x-32.72(R2=0.9251),說明兩個指標間相關性總體比較好。小球藻處于指數生長期時,OD值能較好地反應其生長狀況,而處于生長后期,相關性較差。這個結果與沈萍萍等(2001)報道相同。N50mg/L、P3mg/L處理組細胞密度達到最大值3.91×107個/mL,而N60mg/L時對小球藻的生長產生了略微的抑制作用。圖3結果也表明,N50mg/L、P3mg/L處理組的小球藻在第7天收獲的干重最大,達到5.367mg/mL,而N40mg/L、N60mg/L處理組收獲時最大值分別僅為3.767mg/mL和5.000mg/mL,分別是N50mg/L、P3mg/L處理組最大值的70.2%和93.2%。綜上所述,添加N50mg/L、P3mg/L后小球藻的生物量提高最大。2.2.2葉綠素含量的變化由圖4可以得出,N濃度為50mg/L時小球藻的葉綠素含量基本上均高于N40mg/L和60mg/L。各組在第3天后小球藻葉綠素含量開始快速升高,第7天后開始增長緩慢,甚至呈下降趨勢,基本與生物量的變化規律一致,可能與小球藻生長后期培養液中N含量消耗有關(劉學銘等,1999)。N50mg/L、P3mg/L這組中,葉綠素增長最快且含量最高,達到最大值35.896mg/L。綜合指標分析得出,N50mg/L、P3mg/L時小球藻生長效果最佳,此時的N/P比為16.7∶1。3討論3.1培養碳源的最適ph一般認為微藻最易利用銨態氮。因為銨鹽中的氮處于還原狀態,可以直接參與代謝作用,所以銨鹽比硝酸鹽作為氮源更易被單細胞藻吸收利用。陳貞奮(1984)報道,牟氏角毛藻在銨鹽中培養比在硝酸鹽中培養繁殖得快,但隨著NH4+被利用,培養基pH逐漸下降,會抑制微藻的生長,因而高濃度的銨鹽反而對微藻的生長不利,本研究的結果也證明了這一點。添加氮濃度為60mg/L時,小球藻的OD值、細胞密度和葉綠素等生長指標相對50mg/L時呈下降趨勢。王秀紅等(2006)、蔣漢明等(2004)研究也表明銨態氮濃度過高反而抑制藻生長。另外,碳酸氫銨在提供氮源的同時,也能提供碳源,并能保持培養液中pH較低,更有利于藻類生長。一般認為,單細胞藻直接從水中吸收游離態CO2,碳源不會成為單細胞藻生長繁殖的限制因子。但是隨著單細胞藻對游離CO2的吸收利用,藻液的pH不斷上升,過高的pH會制約藻的生長繁殖。所以以碳酸氫銨作為小球藻的氮源較為理想。3.2浮游植物和浮游藻的最適n/p值Redfield(1958)提出,海水中平均N、P原子比是15∶1,浮游植物在生長時N/P也以15∶1的比例被吸收。但又有實驗室分析認為浮游植物的組成中,N/P是16∶1,后來大多研究者多以此作為浮游植物生長的最適N/P值,比如等鞭金藻和銅綠微囊藻(易文利等,2005;劉東艷等,2002)。但Rhee(1978)、Hecky和Kilham(1988)的研究表明不同的浮游植物有適合各自生長的最適N/P值,中肋骨條藻的最適N/P是12∶1。本試驗結果表明,小球藻在以碳酸氫銨為N源,磷酸二氫鈉為P源時最佳N/P是16.7∶1。本試驗還發現,葉綠素的增量與OD值呈正相關(R2=0.9939)。沈頌東(2003a,b)認為小球藻對N的吸收與N/P值