福建沿海織紋螺毒性消長監測及毒性成分分析

屬于動物門、腹部科、前頭生殖器類、新頭生殖器類、巖舌亞、嗜食動物和紡織螺科，廣泛分布于美國太平洋沿岸、澳大利亞-大陸水域、東大西洋和印度-太平洋沿岸?？椉y螺味道鮮美,我國江蘇、浙江、福建等沿海地區居民都有食用織紋螺的習慣。近幾十年來,食用織紋螺導致的中毒及死亡事件頻繁發生,引起了人們對織紋螺體內毒素種類、來源及毒性變化情況的普遍關注。福建省曾于2002年發生較大規模的食用織紋螺中毒事件,導致3人死亡,數十人中毒,研究結果表明河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)及其同系物是主要的毒素成分。但是,有關該地區織紋螺毒性消長情況及其規律還缺少系統研究,這在很大程度上制約著有關部門對織紋螺中毒事件的有效管理和防范。鑒于此,我們于2006年選擇了福建省三個典型地區進行織紋螺毒性消長的監測,以期了解織紋螺毒性變化情況及其在時間和空間上的變動規律,并進一步確定織紋螺體內的毒素成分,為防范食用織紋螺中毒事件的發生提供科學依據。1材料和方法1.1樣品采集和冷凍保存根據文獻資料對以往中毒事件的報道,選擇了莆田涵江、廈門同安和寧德霞浦三地作為福建沿海織紋螺毒性消長監測的樣品采集地,在2006年3月至9月期間,于當地沿海潮間帶定點采集織紋螺。大約每隔7天采集一次,每次采集300～500粒,樣品采集后迅速冷凍并送往實驗室,于-20℃冷凍保存,待測試分析。采集織紋螺種類的鑒定參照有關文獻資料進行。1.2織紋螺的毒性測定用于毒性測試的織紋螺樣品提取方法參照了AOAC推薦的PSP毒性測試中的提取方法,先前的研究表明該方法可以有效用于織紋螺毒性測定。將織紋螺表面的泥沙沖洗干凈,隨機挑取50粒,夾碎螺殼,取出完整的軟體組織,用組織勻漿器粗勻漿。準確稱取5g勻漿后的組織,加入5mL0.1mol·L-1的HCl溶液,用高速組織分散器處理1～2min,以1mol·L-1HCl溶液將其pH值調整為2～4,于微沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫,再次以1mol·L-1HCl調節pH為2～4,用0.1mol·L-1的HCl溶液將混合物體積定容至10mL,20℃下6000r·min-1離心15min后,取上清液用于毒性測試?？椉y螺毒性測試采用小鼠腹腔注射法,具體過程參照臺灣學者黃登福等建立的測試方法。實驗采用了昆明系雄性小鼠,體重18～21g,購自青島市藥品檢驗所。將1mL毒素粗提液注射入小鼠腹腔,觀察小鼠的反應,記錄下小鼠的死亡時間和體重,并據此測算樣品毒性情況。樣品毒性采用小鼠單位(mouseunit,MU)表示,1MU表示能夠在30min內殺死體重20g小鼠的平均毒素量,大致相當于0.2μgTTX。以0.1mol·L-1的HCl溶液作為空白對照。1.3催化劑和標準毒素選擇高毒性的織紋螺樣品(2006年7月12日采自霞浦),將用于毒性測試的毒素粗提液以0.22μm濾膜過濾后,通過高效液相色譜分析PSP,所采用的毒素分析方法參照Oshima等采用的方法,并略有修訂。PSP的分析采用Waters高效液相色譜系統。用PhenomenexC18反相柱(250mm×4.6mm,5μm)分離毒素;柱后衍生采用Waters雙頭泵分別輸送氧化劑和酸化劑,用Waters溫度控制裝置進行溫度控制,衍生溫度為80℃;用Waters474熒光檢測器進行毒素檢測,激發波長為330nm,發射波長為390nm。用于毒素分析的化學試劑均為色譜純或分析純試劑,包括:磷酸、鹽酸、乙酸、高碘酸、氨水、磷酸二氫鈉和氫氧化鉀等。分析采用的離子對試劑庚基磺酸鹽購自Wako公司。分析用水為經Millipore純水系統凈化的超純水。麻痹性貝毒標準毒素購自加拿大海洋生物研究所海洋分析化學標準組,包括GTX1/4,GTX2/3,GTX5,dcGTX2/3,neoSTX,STX和dcSTX等。用于GTX類毒素分析的洗脫液為含有1mmol·L-1庚基磺酸鈉離子對的10mmol·L-1磷酸銨緩沖液,pH為7.1。用于STX類毒素分析的洗脫液為含有1.5mmol·L-1庚基磺酸鈉離子對的30mmol·L-1磷酸銨緩沖液,pH為7.1,并加入5%的乙腈。氧化劑為含有7mmol·L-1高碘酸的50mmol·L-1磷酸鉀緩沖液,pH為9.0。酸化劑為0.5mol·L-1的乙酸溶液。洗脫液的流速為0.7mL·min-1,氧化劑和酸化劑的流速均為0.4mL·min-1。進樣量為10μL。1.4毒素的提取和分析選擇高毒性的織紋螺樣品(2006年7月12日采自霞浦),取2g勻漿后組織,加入2mL酸化甲醇水(甲醇∶水=80∶20,含0.1%乙酸),震蕩、靜置,進行毒素提取,在20℃下6000r·min-1離心15min,取上清液。向沉淀中再加入2mL酸化甲醇水重復提取1次。合并提取液,在45℃下旋轉蒸發至干。以4mL0.05mol·L-1乙酸溶解殘余物,并定容至5mL。加入等體積二氯甲烷脫脂后,將含有毒素的水相吸出,用3000分子量的超濾離心管(Millipore)在12000r·min-1離心,過濾液用于LC-MS分析TTX。用于TTX分析的化學試劑均為色譜純或分析純試劑,包括:乙腈、甲醇、甲酸、氨水等。分析用水為經Millipore純水系統凈化的超純水。TTX標準毒素購自CALBIOCHEM公司。TTX分析參照于仁成等和李愛峰等的方法,并略有修訂。毒素分析用的LC-MS系統為美國熱電公司(ThermoFinnigan,SanJose,CA,USA)制造,采用電噴霧離子阱質譜檢測器,型號為FinniganLCQTMDecaXPPlus,聯接接口為ESI源。毒素的分離采用親水性色譜柱SeQuantZIC-HILICSilicacolumn(150mm×2.1mm,5μm),購自瑞典SeQuantAB公司。流動相A為含5mmol·L-1甲酸銨和5mmol·L-1甲酸的超純水,流動相B為含5mmol·L-1甲酸銨和5mmol·L-1甲酸的90%乙腈,等梯度洗脫比例為A∶B=30∶70,流速100μL·min-1。進樣量為3μL。2結果2.1主要秀麗織紋螺種采自福建三地的織紋螺種類比較相似。其中采自涵江的樣品主要為半褶織紋螺(Nassariussemiplicatus),其次有少量秀麗織紋螺(N.reticunassa);采自寧德霞浦的樣品主要為半褶織紋螺,另有少量織紋螺未能定種,暫記為Nassariussp.;采自廈門同安的樣品大部分為上述未能定種的織紋螺(Nassariussp.),其次有少量的暗色織紋螺(N.pullus)。2.2樣品消長情況涵江的織紋螺樣品采集時間為2006年3月初至9月初,并且在同一日采集了潮上帶和潮下帶兩個樣品,采集工作進行了22次,總計采集了44個樣品。毒性測試結果顯示陽性樣品檢出率為14%,但是樣品毒性普遍較低(圖1)。最高毒性樣品為3月2日于低潮區采集的半褶織紋螺,毒性為4.41MU·g-1組織(濕重)。從圖1可以看出,該地區采集的陽性樣品集中出現在3月份。在檢測出毒性的織紋螺樣品中,采自高潮區和低潮區的織紋螺毒性差異沒有明顯規律可循。在同安和霞浦兩地進行的織紋螺采樣工作從3月初持續到7月末,在同安總計采集21個樣品,陽性樣品檢出率為43%。陽性樣品集中出現在6、7月份,3月份也有少量陽性樣品檢出(圖2)。樣品毒性較低,最高毒性樣品為3月底采集的半褶織紋螺,毒性為4.71MU·g-1組織(濕重)。在霞浦總計采集了25個樣品,其中陽性樣品檢出率為20%,陽性樣品集中出現在6、7月份,但3月份也有一個陽性樣品檢出(圖3)。霞浦織紋螺樣品的毒性總體較低,但在7月21日采集的織紋螺樣品毒性達到16.2MU·g-1組織(濕重),在所有樣品中毒性最高。綜合這三個采樣點織紋螺毒性的消長情況可以看出,2006年3月至7月,福建省三地的織紋螺樣品毒性總體較低,在2.26～16.2MU·g-1組織(濕重)之間。三地陽性樣品的分布格局呈現一定的地域和季節特征,涵江的陽性樣品集中出現在3月份,而同安和霞浦的陽性樣品則出現了3月份和6,7月份兩個高峰時段。2.3河蚊毒素及其同系物的檢測通過高效液相色譜法對7月21日在霞浦采集的織紋螺樣品進行分析,GTX標準毒素和STX標準毒素的色譜圖如圖4A和4B所示,織紋螺樣品分析的色譜圖如圖4C和4D所示。結果在樣品中沒有檢測到麻痹性貝毒毒素。利用高效液相色譜-質譜聯用方法分析了樣品中的河豚毒素及其同系物,分析色譜圖如圖5所示?？梢钥闯?該樣品中含有河豚毒素TTX(m/z=320.3)和三脫氧河豚毒素trideoxyTTX(m/z=272.3)。TTX毒素的濃度約為4.38μg·g-1組織(濕重)。由于缺少三脫氧河豚毒素的標準,還不能對三脫氧河豚毒素進行定量分析。根據TTX毒素的含量,計算得到的樣品毒性約為19.9MU·g-1組織(濕重),與小鼠生物法測得的結果大致相當。3討論3.1福建對織紋螺的毒性監測市場機制的初步發現食用織紋螺中毒事件在國內多次報道,但是,對于織紋螺毒性消長及其變動規律還缺乏系統的調查和研究。有學者對近20年來浙江舟山市食用織紋螺中毒的事件進行了總結和統計,提出中毒事件的發生存在一定的周期性和季節性特征,中毒事件高發期間隔1～4年,每一年里6-8月份為中毒事件發生的高峰期。也有學者對浙江寧波的織紋螺毒性進行了長達10多年的跟蹤調查,但卻沒有發現明顯的毒性變化規律,毒性變動難以預測。目前尚未有任何地區對織紋螺毒性進行穩定的長期連續觀測。本研究通過對福建三地高密度的樣品采集和毒性監測,初步發現織紋螺的毒性表現出明顯的季節性和區域性差異,陽性樣品集中在3月份和6,7月份出現,根據本文結果,建議福建地區在這兩個時段加強對織紋螺毒性的監測。但是,調查也發現在三個地區之間織紋螺毒性變化特征也有一些差別,要充分闡明毒性變動規律及其機制,還需要長期連續的調查和監測。3.2織紋螺中河蚊毒素及其同系物的檢測由于中毒患者所表現出來的癥狀和PSP中毒癥狀相似,許多國內學者推測,在以往發生的食用織紋螺中毒事件中,織紋螺中的致毒成分是PSP毒素,織紋螺毒性的變動可能和臨近海域赤潮的發生有關,因此,中毒事件可能在赤潮爆發時期發生。但是,通過近年來的研究工作,已有學者從織紋螺中檢測到了河豚毒素及其同系物,表明河豚毒素及其同系物是織紋螺中的主要毒素成分。在本研究中,我們通過高效液相色譜方法確認了這次采集的高毒性織紋螺樣品中不含有麻痹性貝毒毒素,并利用液相色譜-質譜聯用方法在織紋螺中檢測到了河豚毒素及其同系物三脫氧河豚毒素。確認了TTX及其同系物是織紋螺中主要的毒素成分。3.3織紋螺中河蚊毒素的檢測河豚毒素是一種毒性很強的鈉離子通道阻斷劑,在自然界中存在多種同系物,包括4-epiTTX,6-epiTTX,5-deoxyTTX,4,9-anhydroTTX,5,6,11-trideoxyTTX,11-oxoTTX等。自1909年發現河豚毒素以來,已在多種脊椎和無脊椎生物體內檢測到河豚毒素。在織紋螺等多種軟體動物中也曾檢測到河豚毒素。目前學術界對生物體內河豚毒素的來源有兩種不同的看法,一種認為河豚毒素是生物通過各種途徑從外部環境或共生生物中得到的,如通過攝食其它有毒生物積累在體內,或是由與生物共生的細菌分泌產生,目前已有許多學者成功地從河豚魚腸道中分離出了可產生河豚毒素的細菌。另一種看法則認為有的生物本身也可以產生河豚毒素,有研究表明河豚魚胚胎中的河豚毒素含量隨其發育而逐漸增加,認為所增加的河豚毒素是生物自身的產物。對于織紋螺中河豚毒素的來源,目前還不能確定是由織紋螺自身產生還是它從環境中積累得到,而這一點對于了解織紋螺毒性變動規律、有效防范食用織紋螺中毒事件的發生具有重要意義。本研究通過對織紋螺毒性消長的初步研究,為下一步研究織紋螺中毒素的來源提供了重要的背景資料。4織紋螺毒性檢測情況通過對福建省涵江、同安和霞浦三地織紋螺毒性的監測和高毒性織紋螺樣品毒素成分的分析,可以得到如下結論:(1)在2006年3-9