二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建原因

①

;②

。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟2.基因表達(dá)載體的組成

當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。終止子啟動(dòng)子目的基因標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)基因表達(dá)載體（1）啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段。DNA①本質(zhì)：②位置：位于基因的____，緊挨____________。上游轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)③功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：（啟動(dòng)子≠起始密碼子）終止子啟動(dòng)子目的基因標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)基因表達(dá)載體（2）終止子：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段。DNA②位置：位于基因的_____。下游③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。（3）標(biāo)記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選。（4）目的基因：②常見(jiàn)類(lèi)型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。如Bt基因,能控制表達(dá)所需要的特殊性狀。（5）復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動(dòng)子終止子（終止子≠終止密碼子）重組DNA分子限制酶3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？①單酶切法目的基因3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程思考：?jiǎn)蚊盖械姆椒ㄈ毕菔鞘裁矗繂蚊盖腥秉c(diǎn):質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接D.質(zhì)粒與質(zhì)粒連接E.目的基因與目的基因連接如何避免上述問(wèn)題？abab雙酶切的優(yōu)點(diǎn):防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化②雙酶切法圖解限制酶的選擇原則核心歸納1、不能破壞目的基因和標(biāo)記基因（復(fù)制原點(diǎn)）2、切割目的基因兩端——產(chǎn)生4個(gè)黏性末端（平末端）3、為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和確保定向連接——不同的限制酶

(1)基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取(

)(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止密碼子(

)(3)標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因(

)(4)當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以激活或抑制目的基因的表達(dá)(

)判斷正誤××√√1.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？提示不能；因?yàn)镾maⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。2.與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？提示可以防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接。3.下圖為基因表達(dá)載體的模式圖，下列有關(guān)說(shuō)法，錯(cuò)誤的是典題應(yīng)用及時(shí)反饋知識(shí)落實(shí)A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是在生物體外完成的B.任何基因表達(dá)載體的構(gòu)建都是一樣的，沒(méi)有差別C.圖中啟動(dòng)子位于基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選√4.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過(guò)程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無(wú)法避免自身環(huán)化和反

向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)√（1）圖1為某種常用質(zhì)粒的序列圖，LacZ基因編碼的酶能使白色的X﹣gal變?yōu)樗{(lán)色，Ampr為氨芐青霉素抗性基因．圖2為目的基因的序列及其相關(guān)限制酶的識(shí)別序列．請(qǐng)回答下列問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)小組用BamHⅠ和BlgⅡ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，若要篩選成功導(dǎo)入目的基因的重組質(zhì)粒，培養(yǎng)基中應(yīng)加入的物質(zhì)有

和

．氨芐青霉素X﹣gal二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（7）圖1為某種常用質(zhì)粒的序列圖，LacZ基因編碼的酶能使白色的X﹣gal變?yōu)樗{(lán)色，Ampr為氨芐青霉素抗性基因．圖2為目的基因的序列及其相關(guān)限制酶的識(shí)別序列．請(qǐng)回答下列問(wèn)題：成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落顯

，若大腸桿菌菌落顯藍(lán)色，說(shuō)明導(dǎo)入

．沒(méi)有導(dǎo)入任何外源DNA的大腸桿菌

（填“能”或“不能）在該培養(yǎng)基上生存．白色無(wú)目的基因的空質(zhì)粒不能二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法(最多)

導(dǎo)入方法1.花粉管通道法：我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)①用___________將___________________直接注入____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去____，將________滴加在________上，使目的基因借助___________進(jìn)入_____；柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受體細(xì)胞：受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊③花粉管通道法的過(guò)程：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：②農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對(duì)大多數(shù)___________沒(méi)有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將______上的______（___________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其_________________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上

將目的基因插入_____________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞近年來(lái)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（水稻、玉米）中也得到了廣泛應(yīng)用。④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

提醒：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接、兩次導(dǎo)入⑤轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片_______________，然后_____________，并__________；受體細(xì)胞為_(kāi)______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株體細(xì)胞b.可以將____直接浸沒(méi)在________________中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進(jìn)行_____、_____等；受體細(xì)胞為_(kāi)______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵——顯微注射法1.受體細(xì)胞：受精卵(因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性)2.過(guò)程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物（二）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法——Ca2+處理法1.受體細(xì)胞：

常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。2.原核生物的優(yōu)點(diǎn):

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)。3.一般過(guò)程:Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中（感受態(tài)細(xì)胞）（三）導(dǎo)入微生物細(xì)胞Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物注意：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒(méi)有生物活性（無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工），需要在體外進(jìn)行再加工。生物種類(lèi)植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后就說(shuō)明成功了嗎？

檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1.目的:2.檢測(cè)內(nèi)容及方法:類(lèi)型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實(shí)驗(yàn)等1.分子水平的檢測(cè)(1)檢測(cè)目的基因是否插入受體細(xì)胞的DNA中：

技術(shù)。DNA分子雜交或PCR等用放射性同位素標(biāo)記的含有目的基因的單鏈DNA片段制成基因探針。將轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA提取出來(lái)，和基因探針進(jìn)行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明目的基因已插入受體細(xì)胞的DNA中。基因探針：簡(jiǎn)稱(chēng)探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記（同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑）、且順序已知的、與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)。變性15N出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明目的基因成功插入基因組DNA取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA探針：用放射性同位素標(biāo)記的含目的基因序列的DNA片段+（1）檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入DNA和DNA之間1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)DNA分子雜交技術(shù)15N出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明目的基因成功轉(zhuǎn)錄取出轉(zhuǎn)基因生物的mRNA探針：用放射性同位素等標(biāo)記的含目的基因序列的DNA片段+（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄mRNA和DNA之間1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)分子雜交技術(shù)(3)檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)：

技術(shù)。從轉(zhuǎn)基因生物提取出來(lái)的

和

進(jìn)行雜交，如果出現(xiàn)

，說(shuō)明目的基因已經(jīng)翻譯。抗原—抗體雜交蛋白質(zhì)相應(yīng)的抗體雜交帶補(bǔ)充思考：1.在抗原-抗體雜交中，目的蛋白是作為抗原還是抗體？抗原2.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定具體有哪些做法？轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未侵染上病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常目的基因的檢測(cè)與鑒定歸納

(1)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體細(xì)胞(

)(2)Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)，并且與其染色體DNA整合在一起(

)(3)可以將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞(

)(4)檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)可用抗原—抗體雜交技術(shù)(

)(5)用PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，利用了堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(

)(6)基因工程是否成功需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定(

)判斷正誤×√×√√√1.重組Ti質(zhì)粒的構(gòu)建需要哪些酶的作用？提示限制酶、DNA連接酶。2.在用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的過(guò)程中，一定要將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上的原因是什么？提示原因是農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并且整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。3.將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞時(shí)，應(yīng)怎樣處理農(nóng)桿菌細(xì)胞？提示基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞時(shí)，要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細(xì)胞，使其處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，