中國兩個省的耳豆根結線蟲鑒定

根結線蟲（meloidol.）廣泛分布于世界各地，是一種嚴重的植物寄生蟲線蟲。世界每年由根結線蟲所引起經濟上重要農作物的損失占總損失的5%。目前防治根結線蟲病的方法除了化學防治外,還包括植物檢疫、抗性品種、輪作、生物防治等一些非化學性防治措施。對于非化學性防治措施,根結線蟲種的準確鑒定是重要的前提條件。迄今為止,全世界已報道的根結線蟲種已超過90個,中國報道的種類也超過了50種。據調查研究,我國分布最廣泛、最常見的根結線蟲與世界各地類似,包括南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)。近年來,另一種根結線蟲,即象耳豆根結線蟲(M.enterolobii)越來越受到人們的重視。該線蟲是1983年在我國海南省儋州市象耳豆樹上發現的1個新種,該種在報道之后的20余年很少被研究。近來研究發現該線蟲可以寄生豆科、茄科、葫蘆科中的多種經濟作物及番石榴等熱帶水果,還可以寄生攜帶Mi抗性基因的番茄,而且在海南省的三亞、瓊海和澄邁等地也被發現。象耳豆根結線蟲已經成為我國熱帶、亞熱帶地區作物的一個重要潛在病原物。根結線蟲的傳統鑒定方法主要根據形態學,特別是會陰花紋進行,但由于其較大的變異性導致有時結果不夠準確。象耳豆根結線蟲會陰花紋變異較大,部分會陰花紋形態與南方根結線蟲會陰花紋形態相似,如果僅根據該特征,有可能將象耳豆根結線蟲誤定為南方根結線蟲。因此,筆者結合形態學、同工酶及分子生物學手段對從廣東省和海南省采集到的根結線蟲樣品進行鑒定,旨在明確象耳豆根結線蟲除了分布在上述4個地區外,是否在其它地方也有分布,為準確鑒定及控制該線蟲提供理論依據。1材料和方法1.1采集根結線蟲群體2003年至2005年在廣東省的廣州、佛山、江門、番禺、開平、陽江、廉江、湛江、遂溪、雷州、徐聞和海南省的海口、瓊山、定安、屯昌、瓊中等地采集根結線蟲群體。在解剖鏡下,從根結選取單卵塊,接種于預先培植于消毒土的感病品種番茄(滿豐1號)根部,進行活體保存,待用。1.2陰道植物陰血菌的分離和制作觀察雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的形態特征。采集經純化的根結線蟲種群,在解剖鏡下,用鑷子和解剖針分離成熟雌蟲,將雌蟲置于清水中,并移入硬塑料板上按常規方法制作會陰花紋,修正和清洗制作好會陰花紋后,用Olympus高級顯微鏡和掃描電鏡觀察會陰花紋形態,并拍照保存于電腦中。1.3酶系統的檢測參考Esbenshade等的方法稍作改動。采用北京六一儀器廠生產的DYY-Ⅲ-6B型電泳儀,DYY-Ⅲ-23A型垂直板電泳槽,凝膠板大小為125mm×100mm,凝膠厚度1mm。分離膠和濃縮膠同源,電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。酶浸提液為20%蔗糖(W/V)和2%TritonX-100,每個種群挑取4～5個低齡雌蟲制成1個樣品。用50μL微量取樣器加樣,每孔30μL,其中含5μL溴酚蘭溶液,以已知爪哇根結線蟲作對照。電泳時,前1h電壓為80V,其后保持恒壓200V,整個電泳約4h。酯酶(EST)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的染色配方及操作步驟參照Esbenshade等的方法。顯色完全后漂洗3次,在10%醋酸加上10%甘油中固定3h以上,然后掃描并貯存在電腦中。參照Esbenshade等的標準,判讀EST和MDH譜型,初步確定根結線蟲的種類。1.4評估dna1d不同體積的eppendorf管的制備采用微量DNA提取法,主要參照Liao等的方法,略加改動。首先配制WLB液,WLB液包括:2.5mmol/LDTT,1.125%吐溫20,0.025%明膠,2.5倍PCR緩沖液[125mmol/LKCl,25mmol/LTris-HCl(pH8.3),3.75mmol/LMgCl2]。然后在載玻片上滴16μL預冷的WLB液,挑入3～5條2齡根結線蟲幼蟲,用手術刀將線蟲切成多段,迅速吸取含盡量多的線蟲片段的懸浮液8μL,加到含10μL無菌水的Eppendorf管中,再向管中加入2μL預冷的1mg/mL蛋白酶K,使總體積為20μL,迅速放入-70℃冰箱10min以上。接著將Eppendorf管置于65℃恒溫60min,95℃恒溫10min,最后12000r/min離心0.5min。此時即得到DNA懸浮液,可直接用于PCR,也可保存于-20℃。2pcr擴增條件對mtDNA的COII和lRNA基因間序列,采用2對引物進行擴增。2對引物的上游引物均為C2F3,下游引物分別是MRH106和1108。其中引物MRH106位于引物1108下游約130bp處。引物序列分別為C2F3:5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′;MRH106:5′-AATTTCTAAAGACTTTTCTTAGT-3′;1108:5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′。PCR反應體系:DNA模板10～20ng,ExTaq(5U/μL)0.125μL,10×PCR緩沖液2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,引物(10μmol/L)各1μL,加無菌水至25μL。擴增條件:94℃4min;接著94℃1min,50℃1min,72℃2min共35個循環;最后72℃10min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離,每100mL瓊脂糖凝膠加入5μLEB替代物GoldView。電泳緩沖液為0.5×TBE,以5V/cm電壓電泳約30min。用凝膠圖象分析系統照相,并儲存到電腦中。3pcr擴增條件對rDNA的IGS序列,采用引物5S和18S進行擴增。引物序列分別為5S:5′-TTAACTTGCCAGATCGGACG-3′,18S:5′-TCTAATGAGCCGTACGC-3′。PCR反應體系及擴增產物電泳同本文“1.4,2)”。擴增條件:94℃4min;接著94℃0.5min,53℃0.5min,72℃1.5min共35個循環;最后72℃10min。2結果與分析2.1地位變異的陰血工段,不同群體之間的陰道型或惡意程序主要特征為顯微觀察結果表明,采自海南省定安等地的6個根結線蟲群體(表1)形態相似,可能為同1個種。雌蟲蟲體膨大,呈梨形,有明顯突出的頸;頭區無環紋,與頸部稍縊縮,頭冠高,唇盤圓盤狀,略突起;排泄孔位置通常在近中食道球處;口針細長,錐體部與桿部等長,略向背面彎;口針基部球粗大;每個群體內的會陰花紋均有一定的變異,但不同群體之間的會陰花紋變異趨勢類似,其特征為:整體卵圓形或橢圓形,線紋細且較平滑,背弓低至高,大多數會陰花紋無側線,少數具1條或2條不清晰的側線(圖1);雄蟲蠕蟲形,蟲體較小型,體環清晰;頭區高圓,略縊縮,無環紋;頭骨架中等發達;口針直,錐體部尖,桿部與基部球分界清楚;口針基部球大;中食道球卵圓形,瓣膜清楚;排泄孔位置變化較大;尾短、圓;交接刺略彎,基部圓;2齡幼蟲蠕蟲形,體環小而清晰;頭區略縊縮,無環紋,唇盤略高于中唇;口針纖細,錐體部銳尖,與桿部分界明顯;口針基部球清楚、大、圓;透明尾明顯,到尾末端漸變細,末端鈍圓,有1～3次缺刻;直腸稍膨大。主要形態特征與Yang等和劉昊等對象耳豆根結線蟲形態的描述基本相符。主要形態測量值與Yang等報道相比,除雌蟲最大體寬偏小(306.0～693.6μm,375.7～809.7μm)和雄蟲交接刺偏長外(29.0～35.1μm,27.3～32.1μm),其余基本相符。故初步判斷這6個根結線蟲群體為象耳豆根結線蟲。2.2gdh蛋白表達6個根結線蟲群體的2種同功酶表型一致,即Est2條主要酶帶,為VS1-S1型;MDH單1條酶帶,為N1a型。其中GDN1的酶譜圖見圖2。以往的研究已經證明Est-MDH表型是根結線蟲鑒定的可靠依據之一,因此根據已建立的Est-MDH表型圖譜,可判定這6個根結線蟲群體均為象耳豆根結線蟲。2.3coiii/lna基因文庫擴增利用引物C2F3和MRH106對6個根結線蟲群體mtDNA的COII/lRNA基因間序列進行擴增,擴增圖譜見圖3-a。從擴增圖譜可見,所有線蟲群體都擴增獲得1條約850bp的亮帶。同時用引物C2F3和1108對6個根結線蟲群體的COII/lRNA基因間序列進行擴增,擴增圖譜見圖3-b。從擴增圖譜可見,所有線蟲都擴增獲得1條約700bp的亮帶。可見,目的片段大小與文獻報道的象耳豆根結線蟲一致。2.4nas和18s間的igs擴增利用引物5S/18S對象耳豆根結線蟲GDN1的rDNA的5S和18S間IGS區進行擴增,擴增圖譜見圖4。從擴增圖譜可見,該線蟲擴增獲得1條大約800bp的亮帶,目的片段與龍海等報道的象耳豆根結線蟲一致。3根結線蟲與傳統鑒定方法分類鑒定本研究運用比較形態學、同工酶電泳、mtDNA-PCR、rDNA-IGS-PCR相結合的方法,在海南省定安的木豆、海南省海口的木豆和番石榴、廣東省番禺的辣椒和南瓜及廣東省遂溪的豇豆上發現了象耳豆根結線蟲Meloidogyneenterolobii。據報道,迄今象耳豆根結線蟲的發生地僅局限在中國海南省的儋州、三亞、瓊海和澄邁4個地方。本研究不僅在海南省的定安和海口發現象耳豆根結線蟲,而且在廣東省也發現該線蟲。這是首次在海南省外發現該線蟲,推測該線蟲在我國南方亞熱帶、熱帶地區可能有較廣的分布。本次調查新發現豆科(Leguminosae)的木豆和葫蘆科(Cucurbitaceae)的南瓜是該線蟲的寄主新記錄。目前已記載象耳豆根結線蟲可以侵染多種蔬菜、熱帶水果等經濟作物,包括豆科的象耳豆、菜豆、豇豆和大豆;葫蘆科的黃瓜和西瓜;茄科(Solanaceae)的番茄、茄子、辣椒和煙草;桃金娘科(Myrtaceae)的番石榴和蓮霧;番荔枝科(Annonaceae)的番荔枝以及攜帶Mi抗性基因的番茄,造成嚴重的生產損失。這些研究表明該線蟲寄主范圍廣、毒性強,是熱帶、亞熱帶地區一些重要經濟作物的一種重要病原物,因此應該進一步開展該線蟲的調查,尤其是在我國的熱帶和亞熱帶地區,了解該線蟲的分布情況及新的潛在寄主,為采取有效的檢疫措施防止該線蟲傳播提供必要的依據。對根結線蟲的鑒定,傳統方法主要是根據會陰花紋的特征進行鑒定,然而一些研究認為會陰花紋變異很大,僅根據會陰花紋有可能造成誤定;同工酶,尤其酯酶和蘋果酸脫氫酶已經成為根結線蟲鑒定的一種重要手段,但是這一方法也具有一定的局限性。該方法需要活力旺盛的低齡雌蟲,而且有的種會產生多種酶譜帶類型,給鑒定帶來