3T/SDYYXHXX—2023基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性快速評價方法本文件規定了基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性評價的方法原理、受試物、儀器設備、試驗準備、試驗步驟、保證試驗有效性的條件、判定步驟、數據處理與試驗報告等內容。本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性的評價。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1斑馬魚zebrafish模式動物的一種，常用于教學和科研。生物分類學上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、斑馬魚屬、斑馬魚種。3.2Tg（cmcl2:EGFP）品系轉基因斑馬魚Tg（cmcl2:EGFP）straintransgeniczebrafish實驗室常用斑馬魚品系，心臟被綠色熒光標記。3.3性腺發育尚未成熟的斑馬魚。3.4受精后小時數hourspost-fertilization（hpf）斑馬魚胚胎體外受精后的小時數。3.510%致死濃度10%lethalconcentration（LC10）受試物導致10%受試魚死亡的濃度。沒有心跳判定為死亡。3.6心率heartrate心臟每分鐘搏動的次數。3.7SV-BA距離SV-BAdistanceSV-BA距離是指靜脈竇（SV）和動脈球（BA）之間的距離。3.8心室短軸縮短率ventricularfractionalshortening（FS）心室短軸縮短率（FS心室舒張末期內徑（Dd心室收縮末期內徑（Ds/Dd。3.9射血分數ejectionfraction每搏輸出量占心室舒張末期容積的百分比，稱為射血分數。3.10每搏輸出量strokevolume舒張末期容積與收縮末期容積之差，即為每搏輸出量。4T/SDYYXHXX—20234方法原理斑馬魚的心血管系統在解剖結構和生理功能方面與哺乳動物相似，心臟由心房和心室構成，房室之間存在瓣膜，且其心臟的發育及基因調控機制等也與人類相似。受精后48h，靜脈竇、心房、心室發育完成，心臟通過舒縮實現泵血功能。斑馬魚胚胎通體透明，心臟形態和心跳可在顯微鏡下直接觀察，可快速、無創獲取斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量等心功能評價相關指標。因此，以斑馬魚為試驗動物，應用熒光顯微成像等技術，以心率、心包面積、SV-BA距離、射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量等為檢測指標，可對藥物的早期心臟毒性進行快速定量分析。5受試物5.1受試物配制5.1.1水溶性藥物：斑馬魚培養水直接溶解配制成檢測溶液。5.1.2非水溶性藥物：選用有機溶劑、乳化劑或分散劑等進行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁5.2受試物準備量5.2.1固態受試物檢測用量10mg～50mg。5.2.2液態受試物檢測用量30mL～50mL。5.2.3半固態受試物檢測用量20mg～100mg。5.2.4半液態受試物檢測用量20mL～100mL。5.3受試物相關信息5.3.1受試物的名稱、性狀、批號、規格、生產日期、保存條件、保質期。5.3.2受試物為單體成分時，還需要提供該成分相應的化學信息，包括分子量、分子式、分子結構。5.3.3提供受試物理化性質，包含如下信息：a)在水中或其它溶劑中的溶解性；b)在水中和光中的穩定性；c)溫度對受試物穩定性的影響。6儀器設備6.1分析天平。精度0.0001g。6.2體視熒光顯微鏡。6.3圖像采集系統。6.4恒溫光照培養箱。精度±1℃。6.5斑馬魚養殖系統。配備溫控裝置，水循環和過濾裝置。6.6水質監測設備。pH計、溶解氧測定儀、鹽度計。6.7試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應選用惰性材料（如玻璃）來減少吸附。7試驗準備7.1受試斑馬魚發育至48hpf綠色熒光蛋白EGFP標記心臟的轉基因斑馬魚Tg（cmcl2：EGFP）胚胎，使用脫膜劑（配置方法見附錄A）去除包被斑馬魚的外部卵膜。7.2斑馬魚培養水7.2.1斑馬魚培養水使用存放24h以上并經曝氣處理的去離子水配制，內含5mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。5T/SDYYXHXX—20237.2.2斑馬魚培養水配制方法：用分析天平稱取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06gMgSO4·7H2O，加入1000mL純凈水配制成50×斑馬魚培養水。量取20mL的50×斑馬魚培養水，加入980mL純凈水，配制成1×斑馬魚培養水。注：此培養水為斑馬魚提供最適生存水環境。7.3試驗溶液配制7.3.1加入受試物后，試驗溶液pH值在6.5～8.0之間，不需調節試驗溶液的pH值。7.3.2如果加入受試物后試驗溶液的pH值小于6.5或大于8.0，重新配制，調節受試物貯備液的pH值，使其接近加入受試物前稀釋水的pH值。用于調節pH值的物質不應使儲備液的濃度明顯改變，也不應與受試物發生化學反應或產生沉淀。7.3.3非水溶性受試物，添加有機溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受試物試驗溶液中助溶劑濃度不得超過100mg/L。8試驗步驟8.1試驗分組試驗設置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設1個溶劑對照組。8.2空白對照組設置隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，每孔含10尾仔魚和2mL斑馬魚培養水。8.3溶劑對照組設置隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，每孔含10尾仔魚和2mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。8.4陽性對照組設置隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，每孔含10尾仔魚和2mL烏頭堿溶液，烏頭堿溶液濃度為10μM。8.5受試物組設置隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，每孔含10尾仔魚和2mL受試物溶液（配制方法見7.3），受試物試驗溶液濃度需＜LC10（沒有心跳特征的斑馬魚界定為死亡），試驗時根據需要設置多個受試物濃度組。。8.6暴露條件空白對照組、溶劑對照組和受試物組斑馬魚靜置于28.5℃±1℃的恒溫光照培養箱，連續暴露24h。注：暴露期間禁止喂食。8.7心率檢測暴露結束，體視顯微鏡下計數斑馬魚15秒心跳次數，并計算心率。8.8心包面積和SV-BA距離檢測暴露結束，體視熒光顯微鏡下拍照，并測量心包面積以及SV-BA距離。8.9射血分數、短軸縮短率和每搏輸出量檢測暴露結束，倒置熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚心跳視頻，并提取心室舒張末期和收縮末期圖片，測量心室短軸和長軸長度，計算射血分數、短軸縮短率和每搏輸出量。9保證試驗有效性的條件6T/SDYYXHXX—20239.1每孔內斑馬魚密度小于5尾/mL。9.2水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用有機溶劑進行助溶。9.3斑馬魚圖像采集時，各組間拍照參數一致。10判定標準10.1各試驗組暴露完成后至少90%仔魚存活，否則對應試驗組結果無效。10.2受試物組與空白對照組相比，斑馬魚心率、射血分數、短軸縮短率或每搏輸出量在統計學上顯著減?。≒＜0.05），或斑馬魚心包面積、SV-BA距離顯著增加（P＜0.05），此時試驗結果可作為受試物具有心臟毒性的支持證據，但不替代人體功能檢測。11數據處理11.1統計參數：斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量。11.2統計分析方法：方差分析（ANOVA），輔助以T-test檢驗，分析各試驗組間的差異。12試驗報告試驗報告包含下列內容：a)受試物——物理屬性、物理/化學特性；b)受試斑馬魚——學名、品系、來源、發育階段、受精卵收集方法及后續處理；c)試驗條件：1)光照周期；2)試驗設計（試驗容器及其平行的數目，每個平行中的仔魚數量）；3)制備儲備液的方法；若使用助溶劑，應給出其成分和濃度；4)