CCAA團體標準草案編制說明基本信息標準草案名稱中文水體中甲型肝炎病毒檢測方法實時熒光RT-PCR法英文AmethodfordeterminationofhepatitisAvirusinwater---real-timeRT-PCR項目類型√制定□修訂（被修訂標準名稱及編號：）計劃編號2022TB037起止時間2022年11月---2023年10月標準起草單位中華人民共和國丹東海關、莊河市檢驗檢測認證技術服務中心、中國合格評定國家認可中心、本溪市動物疫病預防控制中心、拱北海關技術中心、北京美正生物科技有限公司、浙江諾威檢測認證有限公司、國檢測試控股集團遼寧有限公司。起草組成員麻麗丹、朱金艷、白慶華、王志強、姚麗鋒、周傲白雪、劉磊、陶文靖、陸嘉誠、盛琳、崔亞麗、楊希國、李麗、劉石鑫。項目調(diào)整情況無背景、目的和意義背景水體的安全問題目前已經(jīng)受到了人們的廣泛關注，腸道病毒的水源性爆發(fā)是一項重大的公共衛(wèi)生問題，例如人們生活中的飲用水、食品生產(chǎn)加工用水、水產(chǎn)養(yǎng)殖用水、污水等，這些水如果受到病毒污染，則會給人們的健康帶來極大危害。腸道病毒來源廣，傳播途徑多樣，其中甲肝病毒的環(huán)境適應能力強，能在自然環(huán)境水體中存活很長時間，是對人類健康影響較大的污染物，已經(jīng)導致了多起大規(guī)模的疾病爆發(fā)，引起了人們的廣泛關注。甲肝病毒是最為常見的監(jiān)測項目之一，通常經(jīng)過被糞便污染的水或者食物傳播，也是國際標準中明確需要監(jiān)測的項目。由于環(huán)境樣本中甲肝病毒含量非常低，對病毒的檢測困難，需要一種高效、可靠的病毒富集和檢測方法。目前，國際上主要的檢驗方法有細胞培養(yǎng)法、免疫學方法、PCR方法等，但我國目前沒有水體中甲肝病毒檢驗的相關標準方法。此外，這些方法檢測的前提是需要從水體中富集回收病毒，因此，對于生活和生產(chǎn)中的大體積水的富集回收是一個關鍵技術。目的本標準建立“水體中甲型肝炎病毒檢測方法實時熒光RT-PCR法”體系，包括采用陽離子膜富集小體積水和超濾方法及裝置對大體積水富集回收操作，以及甲肝病毒實時熒光RT-PCR法。意義通過制定此項標準填補我國標準上的空白，為水體中甲肝病毒的富集和檢測提供前沿、高效方法。工作簡況標準主要起草人任務分工麻麗丹、朱金艷、丁寧、劉磊、陶文靖、盛琳：對方法涉及的儀器、耗材、試劑等要求給出明確規(guī)定；對病毒富集及檢測操作流程（濃縮、洗脫、核酸提取、檢測等）給出明確規(guī)定；病毒富集、RT-PCR反應涉及的參數(shù)給出明確規(guī)定；對實時熒光RT-PCR結(jié)果判讀和分析給出明確規(guī)定；起草標準文本。王志強、姚麗鋒、周傲白雪、陸嘉誠、崔亞麗、楊希國、李麗、劉石鑫：方法實驗室內(nèi)驗證和重復性實驗。主要工作過程1.分工情況標準起草組織工作由中華人民共和國丹東海關牽頭負責，主要工作為收集整理國內(nèi)外相關標準和技術資料；制定方法驗證方案、負責檢測方法優(yōu)化建立與驗證、樣品檢驗結(jié)果分析；組織標準起草及實驗室方法可行性驗證，撰寫標準文本和編制說明。2.起草階段2022.11-2023.10：方法驗證和起草征求意見稿；3.征求意見階段2023.11：征集意見和制定標準文本；4.標準審定階段2023.12：標準評審和報送材料。標準編制原則和確定標準主要內(nèi)容的論據(jù)標準編制原則本標準為首次制定，以科學的實驗數(shù)據(jù)為依據(jù)，經(jīng)過科學研究而制定。本標準旨在利用實時熒光RT-PCR法實現(xiàn)水體中甲型肝炎病毒的快速定性檢測。本標準不僅是SN/T4784-2017《出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法實時RT-PCR方法

》的有效補充，同時對其進行了改進。在簡化水樣病毒富集處理的同時，保證了測試的準確性與可重復性，能快速測定水體中的甲肝病毒，提供了一種準確快速的檢測方法，具有廣泛的適用性。同時，本方法在編制過程中引入第三方實驗室對本標準所列方法進行驗證和評價，具有先進性、科學性、合理性和可操作性。確定標準主要內(nèi)容的論據(jù)標準主要內(nèi)容包括兩部分，一部分為水體中甲型肝炎病毒檢測，需要驗證方法的檢出限和重復性；另外一部分需要驗證CS1000plus水體自動采樣富集一體機用于水體中MS2過程控制病毒的濃縮富集回收效果，從而驗證在水體樣品檢測甲型肝炎病毒中應用的適用性，包括MS2的標準曲線的制備，MS2添加到不同水體樣品中的回收率。1、方法的檢出限每份樣本加入50μL甲型肝炎病毒質(zhì)控品的稀釋液,相當于550基因拷貝/500mL瓶裝水樣本,結(jié)果見下表1。表1水中甲型肝炎病毒的檢出限樣品編號甲型肝炎病毒加入量/500mL瓶裝水樣本Ct值結(jié)果判定155038.107陽性255036.874陽性355037.237陽性455037.419陽性555041.074未檢出655039.058陽性755038.232陽性855037.587陽性955038.011陽性1055038.122陽性方法的重復性驗證制備樣本陰性樣本：不添加任何甲型肝炎病毒的水樣本。高水平添加樣本：500mL水樣品中加入1100個基因拷貝的甲型肝炎病毒（每份樣本加入100μL甲型肝炎病毒質(zhì)控品的一萬倍稀釋液,相當于1100基因拷貝/500mL瓶裝水樣本）。驗證結(jié)果見下表2。表2水中甲型肝炎病毒檢測方法的重復性（30個樣品）樣本分組樣本編號添加水平（基因拷貝/500mL）Ct值結(jié)果判定第一組110/陰性1255038.43陽性13110036.91陽性第二組140/1555037.64陽性16110035.88陽性第三組170/陰性1855037.98陽性19110035.70陽性第四組200/陰性21550/陰性22110035.41陽性第五組230/陰性2455037.82陽性25110036.03陽性第六組260/陰性2755038.03陽性28110036.47陽性第七組290/陰性30550/陰性31110035.96陽性第八組320/陰性3355037.53陽性34110035.67陽性第九組350/陰性3655038.69陽性37110035.85陽性第十組380/陰性3955037.89陽性40110035.52陽性水體自動采樣富集一體機富集水體樣本中MS2適用性及回收率驗證MS2標準曲線制備結(jié)果見下表3表3方法的標準曲線濃度MS2原液MS2101×稀釋液MS2102×稀釋液MS2103×稀釋液MS2104×稀釋液Ct值22.38525.77929.03332.68635.783標準曲線y=-3.3703x+22.393相關系數(shù)r＝-0.99973.2水體樣本中MS2回收率驗證實驗取10μLMS2添加到不同的水體樣品中，每種類水體樣品做10個樣本。3.2.1飲用瓶裝水中MS2的回收率實驗見下表4表4飲用瓶裝水樣本MS2的回收率實驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標準偏差RSD%瓶裝水010μL30.46332.26%28.81%21.05%31.12620.51%30.72426.99%30.07841.96%30.70427.36%30.65428.31%30.75126.50%30.3634.61%30.88424.20%30.8125.45%灘涂養(yǎng)殖海水中MS2的回收率實驗見下表5表5灘涂養(yǎng)殖海水樣本MS2的回收率實驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標準偏差RSD%灘涂養(yǎng)殖海水010μL30.59529.48%25.87%22.84%30.49731.52%30.96822.85%31.34117.71%31.30318.17%30.71427.18%30.54430.52%30.54330.54%31.26118.70%30.47532.00%醫(yī)療污水樣本中MS2的回收率實驗見下表6表6醫(yī)療污水樣本MS2的回收率實驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標準偏差RSD%醫(yī)療污水010μL31.15620.09%20.05%20.71%30.69827.47%31.06221.42%31.35817.50%31.78513.07%30.99722.40%30.97622.72%31.48816.01%31.3817.24%30.98922.52%生產(chǎn)用井水樣本MS2的回收率實驗見下表7表7生產(chǎn)用井水樣本MS2的回收率實驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標準偏差RSD%生產(chǎn)用井水010μL30.51931.05%28.38%22.54%30.44132.75%30.37934.16%30.32135.54%30.95323.08%30.97322.77%30.24837.36%31.16120.02%30.94923.14%30.90123.92%生產(chǎn)灌溉水樣本MS2的回收率實驗見下表8表8生產(chǎn)灌溉水樣本MS2的回收率實驗（10個樣品）樣品名稱MS2本底值MS2添加量MS2實測值（Ct）回收率（％）平均回收率（％）相對標準偏差RSD%生產(chǎn)灌溉水010μL30.34834.90%28.03%22.50%30.49431.58%30.66128.18%30.75226.48%30.82725.16%30.68327.76%31.26318.68%30.97822.69%30.12740.58%30.87824.29%現(xiàn)行法律法規(guī)、強制性標準和其他有關標準的關系法律法規(guī)和強制性標準的關系本標準與相關法律法規(guī)、強制性標準保持一致性，不矛盾、不抵觸。與其他有關標準的關系推薦性國家標準：推薦性行業(yè)標準：SN/T4784-2017團體標準：國際標準和國外先進標準：ISO15216-1:2019SN/T4784-2017和ISO15216-1:2019這兩個標準只適用于瓶裝水中甲肝病毒檢測。該方法使用膜吸附-洗脫-濃縮陽離子膜-TGBE-超濾管過濾，對污水、生活用水、生產(chǎn)用水、地下水、集中式供水、娛樂用水、醫(yī)療機構(gòu)污水等中甲肝病毒進行檢測。重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無貫徹該標準的要求和措施建議本方法利用實時熒光RT-PCR法實現(xiàn)水體中甲型肝炎病毒的快速定性檢測。本方法適用于污水、生活用水、生產(chǎn)用水、地下水、集中式供水、娛樂用水、醫(yī)療機構(gòu)污水等中甲肝病毒進行檢測。由于現(xiàn)行行標SN/T4784-2017（出口食品中諾如病毒和甲肝病毒檢測方法實時RT-PCR方