膀胱和淺表性膀胱癌的黏膜涂膜下層組織的光譜學研究

1組織光學特性的測量膀胱內腫瘤是尿液中最常見的腫瘤。尿頭腫瘤的發病率最高。其中，90%以上是移行性細胞癌，約70%-80%是淺表性膀胱腫瘤。熒光光譜、漫反射光譜、拉曼光譜以及紅外光譜等都為腫瘤的光學診斷提供了強有力的診斷手段。研究表明,癌癥的85%以上都起源于人體的內表面的上皮內層組織,大多數這些上皮內層組織的損傷如果能在早期得以確診是容易治療的。膀胱癌早期病變多發生在粘膜層,然后逐漸向粘膜下層及更深層組織入侵。研究表明,人膀胱上皮內層、粘膜及粘膜下層組織的損傷常常是導致膀胱病變的原因。生物組織的漫反射光譜是組織自身固有的吸收與散射之間相互作用的結果,主要取決于組織的光學性質。通過測量生物組織的漫反射光譜來確定組織的光學特性是當前活體組織光學特性無損測量中的研究熱點。生物組織的無損光學法測量就是通過測量組織表面的漫反射光分布。當光束入射到組織時,在組織內不斷地被散射和吸收。從組織內部逸出表面的漫反射光譜攜帶了組織內部的組份和結構等信息,測量組織表面的漫反射率是組織光學特性非入侵法測量的一個非常關鍵的問題。生物組織可看作是一種光學混濁介質,生理特性的改變或癌變等組織特性的變化都導致生物組織的光學特性參量(吸收系數μa、約化散射系數和折射率n等)的改變。生物體的病變導致組織的漫反射光譜的空間和時間的變化可以通過組織光學模型轉變為組織的吸收系數與約化散射系數的比值的相應的變化。本文采用光學法獲取人正常膀胱和淺表膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～900nm光譜范圍的漫反射光譜,利用組織光學模型獲取人吸收系數與約化散射系數的比值。對實驗結果作了詳細的分析和定量比較,為激光應用于膀胱粘膜/粘膜下層組織的診斷和治療提供一點有益的參考數據。2實驗2.1組織光學特性測定實驗用組織樣品來自9個手術切除的人新鮮離體淺表性膀胱癌組織(術后經過病理檢驗為低級別乳頭狀瘤)及其鄰近的正常膀胱組織。組織樣品立即用生理鹽水作簡單沖洗掉表面的血液,并盡快將樣品用生理鹽水保存致超低溫(-75℃)冰箱速凍冷藏。將所有組織樣品用冰凍切片機切割,生成9個面積為20mm×25mm,厚度為(12.56±0.36)mm自然厚度(平均值)的淺表性膀胱癌組織樣品以及9個面積為20mm×25mm,厚度為(10.23±0.29)mm自然厚度(平均值)的正常膀胱組織樣品。然后將組織樣品在自然狀態及室溫20℃環境下分別進行光學特性的測量。從手術切除到樣品準備和測量全過程在23h內完成。2.2組織的高質量測量采用具有積分球附件的Lambda35紫外/可見分光光度計(Perkin-Elmer,USA,model:Lambda35),該附件中的積分球(Labsphere,USA,model:RSA-PE-20)內部直徑為50mm。設置分光光度計的狹縫寬度為2.0nm,掃描的波長范圍設置在300～900nm,設置測定方式為反射。在積分球的樣品反射窗處放置角度為0°的樣品支架,將組織樣品固定在樣品支架上,使得入射光入射到膀胱的粘膜/粘膜下層組織平面上的入射角為0°。所測量的反射率(不包括鏡面反射)為組織樣品的漫反射率(Rs)。移去組織樣品并在樣品反射窗處放置硫酸鋇反射板做參比,所測量的反射率(不包括鏡面反射)為百分之百漫反射率(R100)。移開樣品反射窗處放置的硫酸鋇反射板所測量的反射率為零漫反射率(R0)。在同樣的實驗條件下對膀胱的粘膜/粘膜下層組織進行各項漫反射率的測量,每個組織樣品的測量都使用同一塊硫酸鋇標準板作R100的定標。將18個組織樣品分別按照上述過程在300～900nm光譜范圍內重復測量十次作統計分析處理。由于硫酸鋇標準板的表面的非理想性以及微量的水分,標準板在這個波長范圍的反射率不能達到百分之百的反射率。為此,采用商業用的、已知的高反射率標準板(Labsphere,USA,model:SRS-99-010)作為標準,用分光光度計對硫酸鋇的反射率(RBaSO4)作測量來校準硫酸鋇標準板的實際反射特性。實驗測量的數據由電子計算機數字化后進行數據處理。組織的漫反射率由下式進行計算:Rds=(Rs?R0)/[(R100/RBaSO4)?R0],(1)Rds=(Rs-R0)/[(R100/RBaSΟ4)-R0],(1)從實驗數據可計算出9個正常膀胱和9個淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織樣品在300～900nm光譜范圍的漫反射率及其平均值。Jacques使用倍增法(Adding-doublingmethod)和蒙特卡羅(MonteCarlomethod)法從半無限的各向異性介質(各向異性介質可由Henyey-Greenstein相函數描述)以及介質的折射率獲取了輻射傳輸方程的漫反射率的分析解。利用這個分析解,把各向異性介質的漫反射率的空間和時間的變化轉換為吸收系數與其約化散射系數的比值的相應的變化。因此,利用這個分析解可把正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～900nm的漫反射光譜轉變為組織的的變化情況。計算所用的組織的折射率設為1.4。組織光學參量以均數和標準差(X±SD)表示,采用t檢驗,p<0.05為有顯著性差異,利用統計軟件SPSS10作統計處理。3測量結果的重復性每個組織樣品在同樣實驗條件下重復測量十次來獲取每個測量值,每次測量后便改變樣品上被光輻照的光斑位置進行下一次測量。對于特定的樣品和特定的光譜范圍的測量結果具有很好的重復性。每一組樣品(例如,正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織)所有測量得到的組織光學特性參量用(X±SD)表示。3.1組織中血液成分的變化在300～900nm,正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織對任一個波長的漫反射率都明顯地較淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織對相應波長的漫反射率要大,如圖1所示。正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～320nm的漫反射光譜都是隨著波長的增大而急劇地增大的。在320～415nm,正常組織在320～370nm的漫反射光譜是隨著波長的增大而繼續增大的,在370nm處有一個次峰,其峰值為52.4%。然后在370～415nm是隨著波長的增大而迅速減小的。而淺表性膀胱癌組織的漫反射光譜在300～415nm有一個次峰在320nm處,峰值為43.7%。在320～415nm隨著波長的增大而快速地減小的。可見,在300～415nm處,最大差異為正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜的峰在370nm處,而淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜的峰在320nm處。漫反射光譜在415～520nm都是隨著波長的增大而增大的,而在520～540nm卻都隨著波長的增大而減小的,在520nm處都有一個次峰,其峰值分別為60.7%和33.4%。在540～570nm,正常組織的漫反射光譜在540～550nm是隨著波長的增大而緩慢增大的,而淺表性膀胱癌組織的漫反射光譜在540～550nm是隨著波長的增大而迅速增大的。兩者在550nm處都有一個次峰,其峰值分別為56.1%和30.6%,而在550～570nm處,都是隨著波長的增大而迅速減小的。在570～790nm,正常組織的漫反射光譜在570～600nm隨著波長的增大而迅速增大的,而在600～660nm是隨著波長的增大而緩慢增大的。從660～790nm,隨著波長的增大而緩慢減小的。而淺表性膀胱癌的漫反射光譜在570～660nm是隨著波長的增大而迅速增大的,從660～790nm,隨著波長的增大而緩慢減小的。在這個光譜范圍內,兩者在660nm處都有一個較大的峰,峰值分別為75.5%和70.2%。在790～900nm,都是隨著波長的增大而明顯地增大的。可見,在300～900nm,膀胱癌變導致其粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜特性產生了明顯的差異。這些差異可由組織中的氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的含量的改變及其吸收特性來解釋。組織樣品表面的漫反射光譜的變化主要取決于組織中血液成分的改變,尤其是癌變的與正常的粘膜/粘膜下層組織中所含血液成分和血液量是有明顯的差異的。癌變組織中含有微血管及血液量都較正常組織的要多得多,癌變組織一般都要消耗更多的氧。所以去氧血紅蛋白的含量也較正常組織要多得多。正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜在415nm處的吸收是由組織中的氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白在415nm和430nm處的吸收所共同引起的。正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜在550nm處也都有一個吸收。淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在550nm處的吸收明顯地較正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織在550nm處的吸收要強,這是癌變組織中的去氧血紅蛋白在550nm處的吸收所致的結果。在540nm和570nm處,氧合血紅蛋白都有一個較小的吸收,其導致淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜在540nm和570nm處各有一個明顯的下降。而正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織的漫反射光譜在540nm處的下降很小,而在570nm處有一個明顯的下降,這都是正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織中的氧合血紅蛋白的含量的差異所導致的。正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～900nm的漫反射光譜特性的差異為采用漫反射光譜鑒別診斷膀胱組織的病變提供了一些有益的參考。3.2正常人類社會組織中,各組織之間的a/s的波谷采用倍增法和蒙特卡羅法獲取的輻射傳輸方程的漫反射率的分析解將正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～900nm的漫反射光譜轉換為吸收系數與約化散射系數的比值μa/μ′s隨波長的變化,如圖2所示。在這個光譜范圍內,正常組織對任一個波長的μa/μ′s都明顯地較淺表性膀胱癌的組織對相應波長的μa/μ′s要小,正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～320nm的μa/μ′s都是隨著波長的增大而急劇地減小的。正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織在320～370nm的μa/μ′s是隨著波長的增大而繼續減小的;在370～415nm卻是隨著波長的增大而迅速增大的,在415nm處有一個較強的峰,其峰值為0.049;在415～520nm,隨著波長的增大而迅速減小的。而淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在320～415nm的μa/μ′s卻是隨著波長的增大而急劇增大的,在415nm處也有一個較強的峰,其峰值為0.128;在415～520nm的μa/μ′s卻是隨著波長的增大而急劇減小的。可見,在300～520nm,兩者在415nm處都有一個峰,其峰值的差異為161%。正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s的波谷370nm處,其值為0.021,而淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s的波谷卻在320nm處,其值為0.035。正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s在520～570nm是隨著波長的增大而增大的,在570～660nm隨著波長的增大而迅速減小的,在570nm處有一個次峰,其值為0.024。而淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在520～540nm的μa/μ′s是隨著波長的增大而迅速增大的,在540～550nm卻是隨著波長的增大而迅速減小的,在550～570nm是隨著波長的增大而迅速增大的,在570～660nm卻是隨著波長的增大而迅速減小的。在540nm和570nm處分別有一個次峰,其峰值分別為0.108和0.105。可見,在520～660nm,正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s在570nm處有一個次峰。在540nm和570nm處分別有一個次峰。兩者在570nm處的次峰的峰值的差異為338%。淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s在550nm處有一個波谷,其值為0.074。在660～790nm,兩者都是隨著波長的增大而明顯地增大的,而在790～900nm都是隨著波長的增大而明顯地減小的。790nm處都有一個次峰,其峰值分別為0.012和0.022,峰值的差異為83.3%。這主要是受組織中的氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的吸收情況影響。正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s在415nm處都有一個較強的峰,它們是由組織中的氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白在415nm和430nm處的吸收所共同引起的。淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s在540nm和570nm處都有一個較強的次峰,這主要是由氧合血紅蛋白在540nm和570nm處的吸收所引起的。而正常膀胱的粘膜/粘膜下層組織只在570nm處有一個次峰是由氧合血紅蛋白在570nm處的吸收所引起的。可見,正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織的μa/μ′s的光譜特性主要與組織中的氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的吸收相關,因此,正常膀胱和淺表性膀胱癌的粘膜/粘膜下層組織在300～900nm的μa/μ′s的光譜特性的差異也可為鑒別診斷膀胱組織的病變提供了一些有利的參考。4組織的啟動氧合