細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力檢測(cè)辦法現(xiàn)在重要有兩種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的辦法。一種是直接的辦法，通過直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的辦法，即細(xì)胞活力（cellviability）檢測(cè)辦法，通過檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測(cè)法并不能最后證明檢測(cè)樣品中的細(xì)胞與否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會(huì)自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序，但藥品的干擾可克制凋亡的發(fā)生；這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測(cè)法，顯然能夠分辨兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從藥品干擾組細(xì)胞數(shù)不不大于對(duì)照組的事實(shí)闡明藥品可增進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。因此最直接的證據(jù)應(yīng)當(dāng)采用辦法一。用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力最典型的辦法是用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷解決細(xì)胞，再檢測(cè)DNA鏈中氚含量。若細(xì)胞含有增殖能力，DNA合成過程中將會(huì)采用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷作為合成原料，因此檢測(cè)細(xì)胞DNA鏈內(nèi)標(biāo)記核苷酸的量可判斷細(xì)胞與否進(jìn)行DNA的合成。但更為慣用的辦法是BrdU檢測(cè)法。用BrdU預(yù)解決的細(xì)胞中，BrdU可替代胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，并且這種置換能夠穩(wěn)定存在，并帶到子代細(xì)胞中。細(xì)胞通過固定和變性解決后，可用免疫學(xué)辦法檢測(cè)DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識(shí)別BrdU,再采用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記，最后用比色法或熒光的辦法進(jìn)行定量測(cè)定），從而判斷細(xì)胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一種BrdU檢測(cè)試劑盒，以微孔板的形式，合并全部清洗、固定、變性的環(huán)節(jié)以單一試劑當(dāng)中。比色檢測(cè)在一抗二抗標(biāo)記后在450nm下讀數(shù)，全部操作在3小時(shí)內(nèi)結(jié)束。并且該試劑盒的敏捷度與市場(chǎng)上其它同類產(chǎn)品相比是最強(qiáng)的。1000個(gè)細(xì)胞以上水平的檢測(cè)只需用BrdU預(yù)孵育2小時(shí)，100個(gè)細(xì)胞則采用過夜預(yù)孵育，即可檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。BrdU法的一種缺點(diǎn)是需要固定和變性等破壞DNA的解決。有些狀況下，研究者可能但愿在測(cè)定細(xì)胞增殖能力的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的總DNA含量，然而，在變性條件下，DNA的雙鏈構(gòu)造將被破壞，DAPI和Hoechest33342等核酸標(biāo)記探針就不再能識(shí)別DNA，因而也無法預(yù)計(jì)DNA總量。MolecularProbes公司的Click-iTEdU檢測(cè)試劑盒能夠解決這個(gè)問題。這種辦法不需要變性環(huán)節(jié)，由于熒光探針標(biāo)記的疊氮化物小分子，而不是龐大的抗體分子，能夠很容易的識(shí)別并結(jié)合未變性DNA雙鏈中的EdU分子。采用BrdU辦法時(shí)，你必須非常小心的去對(duì)DNA進(jìn)行變性，才干首先使BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞，另首先又保存足夠的雙鏈DNA分子來進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。有了EdU后則不同，由于你不再需要變性，這一切都很簡(jiǎn)樸了；另外，常慣用于DNA變性的HCl，可能破細(xì)胞內(nèi)壞蛋白的抗原識(shí)別位點(diǎn)，因而限制了BrdU檢測(cè)法中同時(shí)檢測(cè)其它蛋白的應(yīng)用，但這種狀況在EdU法中不存在。圖1：EdU及BrdU原理示意圖（摘至invitrogen闡明書）在某些狀況下，細(xì)胞活力的檢測(cè)相稱于細(xì)胞增殖能力的測(cè)定。用于細(xì)胞活力檢測(cè)的辦法又諸多，這些辦法重要采用特殊的試劑來測(cè)定細(xì)胞的代謝活力，AlamarBlue，MTT及其它四唑鹽。它們通過檢測(cè)細(xì)胞的氧化還原活性來檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，因此這是一種間接的辦法。Calbiochem的快速細(xì)胞增殖試劑盒，或者，嚴(yán)格來說，叫細(xì)胞活力試劑盒，采用一種四唑鹽試劑WST-1來對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行快速的檢測(cè)。線粒體剪切WST－1試劑，產(chǎn)生一種水溶性的formazan鹽，因此這是一種相對(duì)可靠的測(cè)定健康細(xì)胞活力的辦法。一種類似的但更為敏捷的辦法是Calbiochem公司的超敏細(xì)胞增殖試劑盒，采用calcein-AM（一種熒光探針）來標(biāo)記細(xì)胞。這種增加的敏捷度來自于額外的檢測(cè)環(huán)節(jié)，即采用PBS替代培養(yǎng)基或血清來減小背景。Invitrogen公司還提供了一種采用熒光素酶檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平的辦法。健康細(xì)胞中熒光素激發(fā)出的光能夠很容易讀出，并且含有非常小的背景。無熒光信號(hào)表明細(xì)胞線粒體不在產(chǎn)生ATP。因此，這些辦法固然也可用于細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。自由基（FreeRadical,FR）是含有孤電子的原子或原子團(tuán)，活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）是指化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子或原子團(tuán)，涉及超氧陰離子自由基、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧、羥自由基（HO·）、烷過氧化自由基、脂過氧化自由基等。

FR和ROS在細(xì)胞內(nèi)可通過酶反映和非酶反映產(chǎn)生。其中線粒體是細(xì)胞內(nèi)FR和ROS產(chǎn)生的重要來源，約占細(xì)胞內(nèi)FR和ROS總量的98%左右[1]，由于線粒體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)濃度較高，大部分O2·-歧化為H2O2，后者可穿過線粒體膜進(jìn)入胞漿。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)如滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及過氧化物酶體里含有某些酶,如細(xì)胞色素p-450和b3家族、乙醇酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，這些酶對(duì)脂溶性藥品、不飽和脂肪酸、抗生素及其它代謝產(chǎn)物的氧化，亦可產(chǎn)生H2O2和O2·-等[2，3]。除此以外，某些可溶性氧化酶、吞噬細(xì)胞NADP氧化酶、磷脂酶A2(PLA2)等催化的反映，以及某些小分子的自氧化均是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的重要來源[1]，配體反映也可介導(dǎo)產(chǎn)生FR和ROS[4]。

衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為，隨著細(xì)胞復(fù)制衰老或生物整體衰老，F(xiàn)R和ROS在衰老的細(xì)胞和組織內(nèi)累積，損傷生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類、核酸等，造成其構(gòu)造變化和功效喪失，甚至引發(fā)基因突變、DNA復(fù)制停止等，最后引發(fā)復(fù)制衰老和整體衰老，F(xiàn)R和ROS經(jīng)由哪些途徑引發(fā)衰老的呢？

1．FR和ROS可變化細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)重要由谷胱甘肽(GSH)和硫氧還蛋白(TRX)兩對(duì)緩沖對(duì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，F(xiàn)R和ROS可氧化GSH和TRX，變化細(xì)胞內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)，進(jìn)而影響信號(hào)傳導(dǎo)[5]。

2．FR和ROS通過氧化蛋白質(zhì)側(cè)鏈上核心的氨基酸殘基，如絲氨酸的羥基和半胱氨酸巰基，進(jìn)而變化蛋白質(zhì)的構(gòu)造、影響蛋白質(zhì)多聚化、蛋白質(zhì)與Fe-S或其它金屬離子的結(jié)合等。如被氧化修飾的-OH或-SH位于酶的催化中心，則酶的催化活性喪失；如被氧化修飾的氨基酸殘基位于DNA結(jié)合域，則轉(zhuǎn)錄因子失去了與DNA結(jié)合及調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力；而蛋白質(zhì)若不能與Fe-S結(jié)合，則呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化受阻。另外，損傷的蛋白質(zhì)半壽期延長(zhǎng)，而衰老的細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成速率下降，造成受損傷的蛋白質(zhì)更新率下降[6]。

3．FR和ROS可氧化DNA，使其斷裂或突變，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻[7，8]。如果FR和ROS造成的DNA單鏈斷裂發(fā)生于染色體端區(qū)末端，則端區(qū)縮短加緊。在正常培養(yǎng)條件下，人二倍體成纖維細(xì)胞的端區(qū)縮短速率重要取決于細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力[9]。

4．FR和ROS加速了細(xì)胞內(nèi)非酶糖基化反映，以及大分子如蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)[10]。

5．FR和ROS損傷端區(qū)，可能引發(fā)了衰老有關(guān)基因如p16和p21的過體現(xiàn)。MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力

一、原理

噻唑蘭，簡(jiǎn)稱MTT，可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍(lán)紫色的Formazan結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定其光吸取值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。

細(xì)胞活性測(cè)定辦法有臺(tái)盼藍(lán)染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素?fù)饺敕āTT法等。其中MTT法以其快速簡(jiǎn)便，不需要特殊檢測(cè)儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測(cè)的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Formazan，故有時(shí)重復(fù)性略差。為理解決這個(gè)問題，研究人員又開發(fā)了諸多個(gè)水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類辦法作一種簡(jiǎn)樸介紹：

1.MTT法

MTT：化學(xué)名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功效。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定其光吸取值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范疇內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該辦法已廣泛用于某些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥品篩選、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是敏捷度高、經(jīng)濟(jì)。

缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才干檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)成果的精確性產(chǎn)生影響，并且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。2.XTT法

XTT：化學(xué)名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]

-2H-tetrazoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測(cè)快速；3、敏捷度高，甚至能夠測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。

缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK-8法或稱WST-8法

CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為含有高度水溶性的黃色甲產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定其光吸取值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該辦法已被廣泛用于某些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥品篩選、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及藥敏實(shí)驗(yàn)等。

優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測(cè)快速；3、敏捷度高，甚至能夠測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對(duì)細(xì)胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。

缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色靠近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。

三種辦法的比較

MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性難溶性水溶性水溶性檢測(cè)波長(zhǎng)490nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用辦法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需預(yù)制使用有機(jī)溶劑DMSO或其它溶劑——方便性++++++檢測(cè)速度++++++重復(fù)性+++++穩(wěn)定性+++++工作量------對(duì)細(xì)胞毒性------對(duì)人體毒性-----

一、介紹流式細(xì)胞儀（一）流式細(xì)胞儀概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是一種對(duì)處在液流中的細(xì)胞或其它生物微粒（如細(xì)菌）逐個(gè)進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。簡(jiǎn)言之，流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)，F(xiàn)CM以其快速、靈活、大量、敏捷和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐各個(gè)方面，涉及細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢查學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。（二）原理待測(cè)樣本的細(xì)胞懸液，在鞘液的包圍和約束下，細(xì)胞排成單列高速由流動(dòng)室噴嘴噴出，形成細(xì)胞液柱。當(dāng)液柱通過檢測(cè)區(qū)，在入射的激光束照射下產(chǎn)生前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC），它們分別反映細(xì)胞大小和顆粒度，根據(jù)這些特性能夠?qū)⒓?xì)胞分類。經(jīng)一種或幾個(gè)特殊熒光標(biāo)記的樣本，在激光束的激發(fā)下所產(chǎn)生的特定熒光，可被光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)并輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析，得到細(xì)胞對(duì)應(yīng)的多個(gè)特性。（三）流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞特性細(xì)胞構(gòu)造構(gòu)成細(xì)胞功效大小細(xì)胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子、pH值、膜電位酶活性人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)，命名為P53。p53基因的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的兩個(gè)方面，p53是一種重要的抗癌基因使癌細(xì)胞自殺，避免癌變；還含有協(xié)助細(xì)胞基因修復(fù)缺點(diǎn)的功效。這種功效對(duì)于受化療藥品作用而受傷的癌細(xì)胞，則起修復(fù)作用，而不是使癌細(xì)胞自殺。造成被修復(fù)的癌細(xì)胞在治療后成為新的腫瘤。領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院JoelD.Richter專家，這位科學(xué)家對(duì)于發(fā)育與疾病過程中的調(diào)控機(jī)制十分感愛好，至今已發(fā)表有關(guān)研究成果多項(xiàng)，特別是有絲分裂，減數(shù)分裂過程中的機(jī)制。

mRNA的3’端被一段“非模板”的腺嘌呤（即polyA尾端）所覆蓋，其作用是增強(qiáng)它們的翻譯。polyA聚合酶Gld2被序列特異性CPEB蛋白引導(dǎo)到3’端未翻譯的區(qū)域。在這篇文章中，研究人員發(fā)現(xiàn)p53腫瘤克制因子不只是簡(jiǎn)樸地被Gld2多聚腺苷酰化。而是Gld2能夠?qū)⒁环NA添加到miR-122小RNA上，從而使其穩(wěn)定。這種腺苷酰化的miR-122/RISC復(fù)合物然后通過在其3’端未翻譯區(qū)域結(jié)合目的點(diǎn)來克制CPEB的體現(xiàn)。如果CPEB不被miR-122克制，那么CPEB將與p53的3’端未翻譯區(qū)域結(jié)合，并結(jié)合一種不同的polyA聚合酶，即Gld4。這些數(shù)據(jù)反映了p53mRNA的翻譯控制的一種以前人們不懂得的層級(jí)關(guān)系，這一層級(jí)關(guān)系造成細(xì)胞衰老。這種小RNA：miR-122含有許多重要的作用，之前的研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織miR-122的體現(xiàn)與肝癌細(xì)胞周期調(diào)控親密有關(guān)，近來的研究又顯示，miR-122能夠通過影響p53蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白CyclinG的體現(xiàn)，從而減少癌細(xì)胞的侵襲性。這些都闡明了這種小分子與p53的關(guān)系親密。這對(duì)于進(jìn)一步理解p53的作用品有重要的意義。除此之外，有關(guān)p53，近期布魯塞爾自由大學(xué)的研究人員也獲得了新進(jìn)展，他們證明一種重要的腫瘤克制因子p53的某些突變可造成蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊從而在細(xì)胞內(nèi)積聚。這不僅破壞了正常p53的保護(hù)功效，同樣還可累積其它有關(guān)蛋白，從而造成癌癥的發(fā)生。過去的研究表明大概有二分之一的癌癥中都存在p53基因突變，從而科學(xué)家們將其視為開發(fā)新型癌癥治療的重要靶點(diǎn)。而這項(xiàng)研究揭示了突變p53在癌癥中一種新的作用機(jī)制：p53突變使得p53蛋白喪失了它的保護(hù)性功效，并造成這些蛋白質(zhì)變化形狀，互相之間發(fā)生聚合，開始在細(xì)胞內(nèi)積聚。研究成果表明大概1/3的p53突變細(xì)胞存在這樣的作用機(jī)制。研究人員還發(fā)現(xiàn)突變可能造成p53獲得了完全不同的特性，進(jìn)而從抑癌因子轉(zhuǎn)變成為了加速腫瘤生長(zhǎng)的物質(zhì)。在進(jìn)一步的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)突變p53似乎還與細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控分子p63和p73形成了積聚物，從而造成這些調(diào)控分子喪失了本身的功效。美國Brown大學(xué)最新研究發(fā)現(xiàn)，即使在果蠅神經(jīng)細(xì)胞中的瘤克制蛋白p53的活性減少的狀況下，果蠅仍然能健康存活很長(zhǎng)時(shí)間。論文發(fā)表在最新一期的國際生物學(xué)期刊《CurrentBiology》中，研究成果為p53的功效研究提供了重要的信息，"基因組的守護(hù)神"——p53對(duì)抗衰老藥品的研究也含有一定的參考價(jià)值。P53基因在體內(nèi)含有重要的地位。它通過產(chǎn)生一種能引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡的蛋白質(zhì)來保護(hù)人類細(xì)胞，或是在DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)促使細(xì)胞自殺，這樣便能夠制止遺傳突變的擴(kuò)展和癌癥的形成。當(dāng)p53受損或缺失時(shí)，就會(huì)造成癌癥。事實(shí)上，有53％的癌癥患者攜帶有p53突變體。然而，當(dāng)人類的守護(hù)基因p53極度活躍，瘤克制蛋白比正常水平更高的時(shí)候，老鼠的衰老進(jìn)程就會(huì)加速并且壽命縮短。生物學(xué)家StephenHelfand等的研究顯示，p53基因中存在一種“臨界點(diǎn)”。如果p53蛋白的含量低于這個(gè)"臨界點(diǎn)"，特別是神經(jīng)細(xì)胞中的p53，便能延長(zhǎng)果蠅的健康生存時(shí)間。因此，p53活性的減少對(duì)衰老會(huì)產(chǎn)生重大的影響。美國康涅狄格大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)p53蛋白進(jìn)行修飾能夠延長(zhǎng)壽命，Brown大學(xué)的Helfand專家等用果蠅進(jìn)行了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。由于果蠅中有數(shù)千個(gè)基因與人類相似，并且它也體現(xiàn)p53基因。實(shí)驗(yàn)中用的果蠅攜帶有p53的突變體，當(dāng)突變基因體現(xiàn)后，會(huì)產(chǎn)生一種突變體進(jìn)而形成新的p53蛋白，該蛋白會(huì)使正常的p53蛋白失活，但是這種影響只發(fā)生在神經(jīng)細(xì)胞中。為什么挑選神經(jīng)細(xì)胞來做實(shí)驗(yàn)?zāi)兀坑捎诔墒斓纳窠?jīng)細(xì)胞不會(huì)分裂，這樣發(fā)展為癌癥的幾率就比較小。研究成果顯示，攜帶成熟突變體的果蠅中58％都會(huì)長(zhǎng)壽，平均壽命為60天，而正常狀況下果蠅的平均壽命為38天。與此同時(shí)，果蠅還會(huì)健康生長(zhǎng)，還會(huì)繼續(xù)取食、運(yùn)動(dòng)以及繁殖后裔。但是，現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)還不能解釋為什么p53活性的減少能延長(zhǎng)壽命。有現(xiàn)象暗示這是卡路里限制的因素，這一生化機(jī)理能夠延緩衰老。為了檢查這個(gè)構(gòu)想，研究人員不進(jìn)行卡路里限制，喂養(yǎng)了某些果蠅，發(fā)現(xiàn)果蠅不再長(zhǎng)壽，這表明了該途徑是存在的。p53和pRB蛋白是兩種核心的腫瘤克制因子，在誘導(dǎo)衰老方面有著決定性的作用，普通我們說的兩條衰老信號(hào)通路是指pRB信號(hào)通路和p53信號(hào)通路。人類的細(xì)胞衰老通路體現(xiàn)為兩條平行的（與小鼠的一條形成對(duì)比）通路，這樣將使得細(xì)胞不容易繞過衰老過程，從而克制了腫瘤的發(fā)生。但是這種構(gòu)想受到了近年來的某些實(shí)驗(yàn)的挑戰(zhàn)，如人的肺成纖維細(xì)胞，通過體細(xì)胞同源重組技術(shù)，使得p53或PRB失活，能夠避開衰老過程，這就有些像小鼠身上的單線狀的衰老通路(Weietal.,)；并且，與小鼠形成對(duì)照的是，通過同源重組造成的p21的失活足以避開衰老過程，表明了p21作為p53和PRB兩通路的聯(lián)系者的身份(Brownetal.,1997a)。有關(guān)p53和PRB蛋白的作用，現(xiàn)在有一種比較承認(rèn)的見解是：p53通路介導(dǎo)的是端粒功效異常、DNA損傷引發(fā)的衰老過程；p16/pRB通路介導(dǎo)的是致癌基因的體現(xiàn)、染色質(zhì)斷裂、多個(gè)多樣的脅迫等等引發(fā)的衰老過程(WrightandShay,;CollinsandSedivy,;BenPorathandWeinberg,)。但是現(xiàn)在這兩條通路的標(biāo)志性分子尚未找到，并且在不同種、組織的細(xì)胞中兩條通路的重要性又有所不同，因此對(duì)于衰老通路的理解正處在不停深化的過程中。下面簡(jiǎn)樸看一下兩個(gè)通路狀況：(一)p53通路p53蛋白能夠激活下游分子，如p21CIP1/WAF1(KuljuandLehman,1995)，或是其它的蛋白分子來激活pRB實(shí)現(xiàn)衰老過程（小鼠）；并且，在人身上，能夠不依賴PRB激活衰老。p53的失活會(huì)造成某些復(fù)制型衰老的細(xì)胞徹底地逆轉(zhuǎn)衰老過程(GireandWynford-Thomas,1998)。類似地，p21（p53的轉(zhuǎn)錄激活的靶子，是一種細(xì)胞周期循環(huán)的克制分子）的失活，會(huì)使得細(xì)胞繞過端粒依賴的復(fù)制型衰老，進(jìn)入一種危機(jī)狀態(tài)(Brownetal.,1997b)。p53的激活是通過磷酸化（ATM/ATR，Chk1/Chk2蛋白分子的功績(jī)），p19(ARF)(克制Mdm2)的激活來實(shí)現(xiàn)。p53在細(xì)胞對(duì)DNA損傷反映（涉及衰老反映）過程中是一種核心性的調(diào)節(jié)因子(WahlandCarr,)。在人的細(xì)胞中，p53的缺失會(huì)延遲或是阻斷復(fù)制型衰老(Itahanaetal.,)。致癌基因RAS的體現(xiàn)通過ROS來實(shí)現(xiàn)，而ROS是在促有絲分裂以及促細(xì)胞衰老的過程中是必需的。RAS的過量體現(xiàn)，可能會(huì)通過p53依賴的損傷反映（即產(chǎn)生大量的DNA損傷的ROS）來造成衰老反映；同時(shí)RAS也會(huì)誘導(dǎo)p16的體現(xiàn)，p16是pRB的激活劑(Ferbeyreetal.,;Pearsonetal.,;Serranoetal.,1997)。兩個(gè)蛋白都能妨礙潛在的腫瘤細(xì)胞的增殖。總之，在某些細(xì)胞中，DNA損傷引發(fā)的衰老感應(yīng)，端粒異常，以及某些致癌性基因的體現(xiàn)會(huì)通過p53通路來造成細(xì)胞衰老，p53通路在當(dāng)中起的作用不僅是必要并且還是充足條件。（二）pRB通路p53對(duì)于某些細(xì)胞逆轉(zhuǎn)衰老克制非常有效，但也不居然(Beausejouretal.,c;Herbigetal.,b;Sakamotoetal.,1993)。有些細(xì)胞在p53敲除后，還能呈現(xiàn)衰老狀態(tài)。這種細(xì)胞往往或多或少地體現(xiàn)細(xì)胞周期的克制因子p16。小鼠體內(nèi)的研究表明p16妨礙了自發(fā)性的惡性腫瘤的發(fā)生(Sharplessetal.,)。細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明，p16制止了由p53失活引發(fā)的逆轉(zhuǎn)衰老的現(xiàn)象；并且對(duì)RAS引導(dǎo)的衰老過程是必需的(Beausejouretal.,b;BenantiandGalloway,a;Brookesetal.,)。p16的體現(xiàn)通過脅迫