腎缺血再灌注模型的建立及腎臟缺血時(shí)間對(duì)其影響的評(píng)價(jià)

0腎iri的發(fā)病機(jī)制腎衰竭的后錨爾茨坦損傷（iri）是腎衰竭的主要發(fā)病機(jī)制，發(fā)病率和死亡率較高。一系列連續(xù)的細(xì)胞事件，如活性氧（ros）、壞死、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和活性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致組織損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是開(kāi)展腎IRI研究的常用方法,合格的動(dòng)物模型建立是實(shí)驗(yàn)研究成功的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。作者應(yīng)用微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂方法制備BALB/c小鼠IRI模型,取得較為滿意的效果,并觀察了不同的腎臟缺血時(shí)間對(duì)腎IRI的影響。1腎損害評(píng)估方法設(shè)計(jì):單一樣本觀察。時(shí)間及地點(diǎn):實(shí)驗(yàn)于2009-01/07在法國(guó)巴黎第五大學(xué)附屬COCHIN醫(yī)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(BSL-4)完成。材料:清潔級(jí)6~8周齡雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量20~25g,均由巴黎第五大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬COCHIN醫(yī)院免疫實(shí)驗(yàn)室提供,微型動(dòng)脈夾由法國(guó)Moria公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。實(shí)驗(yàn)方法:動(dòng)物分組:31只小鼠根據(jù)腎缺血時(shí)間不同隨機(jī)分為:0min組對(duì)照組(n=4)、30min(n=8)、35min(n=8)和45min(n=11)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。另取26只小鼠觀察腎缺血45min生存率,隨機(jī)分為0min對(duì)照組(n=4)和45min實(shí)驗(yàn)組(n=22)。手術(shù)程序:小鼠術(shù)前8~12h禁食,應(yīng)用三溴乙醇溶液(200mg/kg)經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉。實(shí)驗(yàn)組:沿腹正中線做1.5~2.0cm的切口,逐層分離皮膚、腹膜,進(jìn)入腹腔,將腸道推向一側(cè),找到腎蒂后用無(wú)損傷微型動(dòng)脈夾迅速阻斷左右腎蒂,可見(jiàn)腎臟由鮮紅變紫黑色,表示夾閉成功,按分組不同持續(xù)夾閉腎蒂不同的時(shí)間,去除動(dòng)脈夾,恢復(fù)血流灌注,可見(jiàn)腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅,恢復(fù)原來(lái)顏色,術(shù)畢分層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后小鼠于24~29℃的環(huán)境保暖,補(bǔ)充水與飼料。術(shù)中應(yīng)用生理鹽水使小鼠保持充分的水化。對(duì)照組:同法打開(kāi)腹腔并找到腎蒂,但不夾閉腎蒂。模型成功與否判定:造模成功:術(shù)中夾閉雙側(cè)腎蒂后,可見(jiàn)腎臟由鮮紅變紫黑色,去除動(dòng)脈夾,恢復(fù)血流灌注,可見(jiàn)腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅,恢復(fù)原來(lái)顏色;并且術(shù)后1~3h,可見(jiàn)小鼠蘇醒,逐漸恢復(fù)正常活動(dòng)。造模不成功:腎臟恢復(fù)血流后5min,腎臟未恢復(fù)正常顏色;或術(shù)中損傷周?chē)M織或器官;或術(shù)后1~3h,小鼠未蘇醒或死亡。血清生化指標(biāo)檢測(cè):腎臟灌注后24h,經(jīng)眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血0.3~0.5mL,4500r/min10min離心后吸取血清,檢測(cè)肌酐和尿素氮。腎臟病理組織學(xué)檢測(cè):腎臟灌注后24h,引頸法處死小鼠,取出腎臟,行縱軸冠狀面切開(kāi),置于體積分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋,制作4μm切片,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管壞死情況。每只小鼠腎臟切片隨機(jī)選取20個(gè)視野觀察,根據(jù)腎小管壞死程度,采用Rabb等的半定量病理評(píng)估法評(píng)分:評(píng)分越高說(shuō)明腎小管壞死越嚴(yán)重(最高4分),0分:正常腎臟;1分:最少壞死(<5%的腎小管壞死);2分:輕度壞死(5%~25%的腎小管壞死);3分:中度壞死(25%~75%的腎小管壞死);4分:重度壞死(>75%的腎小管壞死)。生存率觀察:腎缺血45min生存率觀察小鼠造模成功后不處死動(dòng)物,每天定時(shí)觀察和記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)情況,至術(shù)后1周,記錄動(dòng)物的死亡時(shí)間。主要觀察指標(biāo):雄性BALB/c小鼠不同腎缺血時(shí)間,血清腎功能和腎臟組織學(xué)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用GraphPadPrism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料組間差異采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料組間差異采用χ2檢驗(yàn),累計(jì)生存率的比較采用KaplanMeier分析。2結(jié)果2.1小鼠血清尿素氮的變化對(duì)照組小鼠全部成功,術(shù)中、術(shù)后均未見(jiàn)小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)組49只小鼠,模型成功47例,成功率為95.9%。實(shí)驗(yàn)組手術(shù)成功率與對(duì)照組差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。2.2小鼠經(jīng)歷不同時(shí)間腎缺血血清生化指標(biāo)變化本組實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組(0min組)小鼠血清肌酐約14μmol/L,尿素氮約6.7mmol/L。小鼠經(jīng)歷30min腎臟缺血,再灌注后24h血清肌酐和尿素氮值開(kāi)始升高,分別達(dá)到(34.25±8.62)μmol/L和(18.28±2.45)mmol/L,經(jīng)歷35~45min腎臟缺血,再灌注后24h血清肌酐和尿素氮值明顯升高,分別達(dá)到(239.2±15.82)μmol/L和(56.68±2.84)mmol/L,與對(duì)照組相比,差異均有顯著性意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。小鼠經(jīng)歷0,30,35,45min腎缺血,再灌注后24h血清肌酐和尿素氮的變化。2.3病理?yè)p傷評(píng)分實(shí)驗(yàn)組(30min組、35min組、45min組)灌注后24h腎小管病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果,見(jiàn)圖2。30min組、35min組、45min組病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組,代表性蘇木精-伊紅染色圖,見(jiàn)圖3。小鼠經(jīng)歷0,30,35,45min腎缺血,再灌注后24h腎小管病理?yè)p傷評(píng)分。2.4腎iri模型建立的意義對(duì)照組在觀察期間外觀、活動(dòng)及進(jìn)食無(wú)顯著異常,術(shù)后觀察1周全部存活;小鼠腎缺血45min組出現(xiàn)不同程度的精神萎糜、活動(dòng)量減少和進(jìn)食減少,隨著觀察時(shí)間的推移,逐漸出現(xiàn)死亡,術(shù)后24~48h為小鼠死亡高峰期,觀察1周生存率明顯低于對(duì)照組,見(jiàn)圖4,兩組差異有非常顯著性意義(P<0.01),小鼠腎缺血45min組術(shù)后第7天生存率只有13.64%。IRI是指組織缺血一段時(shí)間,當(dāng)血流重新恢復(fù)后,細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而較缺血時(shí)進(jìn)一步加重,器官功能進(jìn)一步惡化的臨床綜合征。IRI具有種屬、器官的普遍性和廣泛性,在臨床上常見(jiàn)于動(dòng)脈阻塞性疾病治療過(guò)程中、器官移植、術(shù)中血流阻斷、休克、心肺復(fù)蘇等情況。IRI對(duì)器官的功能和組織結(jié)構(gòu)都可以造成明顯的損傷,甚至引起急、慢性器官衰竭。腎臟為高灌注器官,對(duì)缺血及缺血再灌注均敏感。腎IRI是臨床上常見(jiàn)的病理生理過(guò)程,是引起急性腎功能衰竭的重要原因之一,常常難于避免,臨床各科均可發(fā)生,而且病情兇險(xiǎn),搶救過(guò)程中各種治療干預(yù)極其復(fù)雜,各國(guó)研究者都在尋求辦法解決這個(gè)問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是開(kāi)展腎缺血-再灌注損傷研究的常用方法,合格的動(dòng)物模型建立是實(shí)驗(yàn)研究成功的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。豬、兔等均用于本模型建立,但以大鼠最常用。對(duì)于一些藥物作用的研究,大型動(dòng)物藥物消耗量大,如果擬使用的實(shí)驗(yàn)藥品價(jià)格昂貴,小型動(dòng)物如小鼠便是理想的造模工具。另一方面,由于小鼠較為嬌嫩,對(duì)麻醉和手術(shù)的耐受性相對(duì)較差,腎臟及腎蒂小且難于尋找,造模難度大,容易增加實(shí)驗(yàn)誤差以及導(dǎo)致造模的失敗。目前,國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用大鼠建立腎IRI模型,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BALB/c小鼠造模49例,模型成功率為95.9%,取得了良好的造模效果,作者的體會(huì)是:(1)術(shù)前小鼠禁食8~12h,可避免術(shù)中胃腸道的干擾。(2)麻醉不可過(guò)深,否則小鼠術(shù)后很難蘇醒。(3)術(shù)中尤其缺血等待期應(yīng)保持小鼠腹腔充分水化。(4)術(shù)中術(shù)后應(yīng)充分保暖,使室溫保持24~29℃為宜。(5)分離腎蒂時(shí)要十分小心,鈍性分離,只對(duì)腎蒂下方和背側(cè)充分游離后即可上動(dòng)脈夾,其余部分盡量減少干擾。(6)上動(dòng)脈夾阻斷腎蒂時(shí)要一次性成功,盡量不要松開(kāi)夾子第2次上夾,否則容易發(fā)生缺血預(yù)處理,使腎臟對(duì)缺血的耐受性增加。(7)注意不要損傷腹腔內(nèi)組織而出血,尤其在阻斷右側(cè)腎蒂時(shí)避免損傷肝臟以及阻斷左側(cè)腎蒂時(shí)避免損傷脾臟出血,小鼠若一次性出血大于0.5mL,很容易出現(xiàn)休克而死亡。(8)術(shù)畢關(guān)腹前腹腔內(nèi)補(bǔ)液0.1~0.2mL,有助于術(shù)后小鼠的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BALB/c小鼠腎缺血30min,再灌注24h血肌酐和尿素氮即開(kāi)始升高,與對(duì)照組相比,其差異有顯著性意義(P<0.05),并且隨著腎缺血時(shí)間的延長(zhǎng),血肌酐和尿素氮逐漸升高,病理組織學(xué)顯示,小鼠腎缺血45min,產(chǎn)生廣泛的腎小管壞死。實(shí)驗(yàn)觀察雄性BALB/c小鼠腎缺血45min后生存情況,顯示小鼠腎再灌注后24h逐漸出現(xiàn)精神萎糜、活動(dòng)量減少和進(jìn)食減少等急性腎功能衰竭的表現(xiàn),再灌注后48h小鼠死亡達(dá)到高峰,術(shù)后第7天生存率只有13.64%。而daSilva等和Kale等分別應(yīng)用C57BL/6鼠和Rosa26鼠制作腎IRI模型顯示,小鼠腎缺血35~45min,其血清尿素氮將在灌注后24~48h達(dá)到峰值,并且沒(méi)有小鼠能夠存活超過(guò)術(shù)后24h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他們的不一致可能是由于小鼠的系別不同而造成。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者認(rèn)為應(yīng)用微型動(dòng)脈夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂的方法可制備穩(wěn)定腎IRI模型,雄性小鼠腎缺血35~45min是造模較為理想的腎缺血時(shí)間,所得模型效果滿意。對(duì)照組(0min組)腎臟形態(tài)、大小、色澤正常;而實(shí)驗(yàn)組(30min組、35min組和45min組)腎臟稍腫大,剖面見(jiàn)皮質(zhì)蒼白,髓質(zhì)淤血暗紅。蘇木精-伊紅染色光鏡檢查顯