飼料中維生素的快速鑒別

維生素是飼料中的重要組成部分。這是一組不同結構、不同生理功能和營養功能的化學。動物對維生素的需要量極微,但其生理、營養作用顯著。所以在飼料中是否加入維生素、加入的量是否準確,對動物的生長、發育和養殖企業獲得的經濟效益都會受到很大的影響。《飼料添加劑品種目錄》列出的維生素有32種,分為兩類:一類是脂溶性維生素,包括維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K3;另一類是水溶性維生素,包括B族維生素和維生素C等。維生素的測定方法包括高效液相色譜法、分光光度法、熒光光度法。而高效液相色譜法是目前使用最多、比較理想的維生素分析方法,它具有分離效果好、靈敏度高、特異性強等特點,特別對于預混合飼料和配合飼料中的維生素,含量低,干擾成分多的情況下,只能用高效液相色譜法進行鑒別及含量分析。本文主要介紹了維生素預混合飼料或配合飼料中維生素的鑒別及含量分析方法,以提供給廣大飼料生產和養殖企業作為參考。1.1維生素A的鑒別及含量測定方法單體的維生素A肉眼看為淡褐色或灰黃色顆粒。1.1.1預混合飼料中維生素A的鑒別方法。取試樣2~3g,加氯仿10mL,充分研磨,靜置片刻后取少許上清液于點滴板上,加入1滴三氯化銻試液,即呈藍色。該法可鑒定出維生素A含量低至50mg/kg的預混料。操作中要注意的是必須充分研磨試樣,因為維生素A原料一般均用明膠包膜,充分研磨才能使維生素A充分釋放出來。如果只用溶劑溶解而未研磨,那么在鑒定低含量維生素A的預混料時可能會導致錯誤的結論。1.1.2飼料中維生素A的含量測定。根據《GB/T17817—2010飼料中維生素A的測定高效液相色譜法》標準可進行真偽判別。該標準是近年新修訂的分析方法,是在原來皂化提取法的基礎上新增加了直接提取法。對于維生素預混合飼料中的維生素A乙酸酯的測定簡單、快捷了。該標準含有兩種分析方法。第一法:皂化提取法(仲裁法),適用于配合飼料、濃縮飼料、復合預混合飼料、維生素預混合飼料中的維生素A的測定。定量限為:1000IU/kg。其原理為堿溶液皂化試樣后,用乙醚將維生素A提取出來,蒸除溶劑,殘渣溶于適當溶劑,用正相或反相高效液相色譜分析柱,在326nm波長條件下測定,外標法計算維生素A的含量。第二法:直接提取法適用于維生素預混合飼料中的維生素A乙酸酯的測定,定量限為:344mg/kg(106IU/kg)。其原理為維生素預混合飼料中的維生素A乙酸酯用甲醇溶液提取,試液注入反相色譜分離,在326nm波長條件下測定,外標法計算維生素A的含量。1.2維生素D3的鑒別及含量測定方法1.2.1預混合飼料中維生素D3的鑒別方法。取試樣2~3g,加氯仿10mL充分研磨后過濾或靜置,然后取少許濾液或上清液于小試管,滴加乙酸酐6滴,搖勻,沿管壁滴2滴硫酸,觀察液面變化,若含維生素D3,在硫酸與液面接觸時應立即顯藍色,漸漸又轉為紫紅色。與單體鑒別及含量測定方法相比,操作時應注意幾個問題:一是硫酸與樣品溶液接觸時立即就顯藍色,一般看不到由黃變紅的變化;二是必須充分研磨樣品,因商品維生素D3大多制成包膜微粒,需研磨維生素D3才能釋放出來;三是遇到難以過濾的樣品,可取上清液試驗;四是加硫酸時最好不要搖勻,而是讓其沿試管壁緩緩接觸液面,并留意觀察硫酸與液面接觸一剎那顏色的變化,這一點對鑒別維生素D3含量較低的預混料(小于5mg/kg)尤其重要,因有時一振搖反而會看不到反應現象了。1.2.2飼料中維生素D3的含量測定。《GB/T17818—2010飼料中維生素D3的測定高效液相色譜法》標準也是近年新修訂的分析方法,與維生素A相同。該法在原來皂化提取法的基礎上新增加了直接提取法。對于維生素預混合飼料中的維生素D3的測定簡單、快捷了。該標準含有兩種分析方法。第一法:皂化提取法(仲裁法)適用于配合飼料、濃縮飼料、復合預混合飼料、維生素預混合飼料中的維生素D3的測定。定量限為:12.5μg/kg(500IU/kg)。其原理為堿溶液皂化試樣,乙醚提取維生素D3,蒸除溶劑,殘渣溶于甲醇并將部分溶液注入高效液相色譜反相凈化柱,收集含維生素D3淋洗液,蒸發至干,溶解于適當溶劑中,用正相或反相高效液相色譜分析柱,在264nm波長條件下測定,外標法計算維生素D3的含量。第二法:直接提取法適用于維生素預混合飼料中的維生素D3的測定,定量限為125mg/kg(5×106IU/kg)。其原理為維生素預混合飼料中的維生素D3用甲醇溶液提取,試液注入反相色譜分離,在264nm波長條件下測定,外標法計算維生素D3的含量。實踐應用中維生素A、D3的測定通常同時進行。1.3維生素E的鑒別及含量測定方法維生素E單體的外觀呈白色或淡黃色粉末。1.3.1預混合飼料中維生素E的鑒別方法。預混料中維生素E的鑒別與單體維生素E的鑒別方法基本相同,但取樣量要適當加大。具體操作如下:取樣品1~2g,加無水乙醇10mL充分研磨過濾,取濾液2mL,加硝酸1mL,置75℃水浴中加熱15min,至溶液呈橙紅或紅色。操作過程中要注意兩點:一是溶液加熱后出現橙紅色所需時間的長短與維生素E的含量有關,含維生素E量較高的預混料(如10g/kg以上),其溶液經反應轉變為橙紅色只需2~3min,而低含量預混料(如1g/kg以下)所需反應時間則長得多,超過10min,且顏色由淺逐漸變深,因此要耐心觀察,以免誤判。二是加熱時溫度要控制在75℃以下。1.3.2飼料中維生素E的含量測定。根據《GB/T17812—2008飼料中維生素E的測定高效液相色譜法》標準,其分析方法與維生素A相似。該法在原來皂化提取法的基礎上新增加了直接提取法。對于維生素預混合飼料中的維生素E的測定簡單、快捷了。該標準含有兩種分析方法。第一法:皂化提取法(仲裁法)適用于配合飼料、濃縮飼料、復合預混合飼料、維生素預混合飼料中的維生素E(dl-α-生育酚)的測定。定量限為:1mg/kg。其原理為用堿溶液皂化試樣,使試樣中的天然生育酚釋放出來,添加的dl-α-生育酚乙酸酯轉化為游離的dl-α-生育酚,乙醚提取,蒸發乙醚,殘渣溶于正己烷。注入正相或反相高效液相色譜分析柱,用紫外檢測器在280nm波長測定,外標法計算維生素E(dl-α-生育酚)的含量。第二法:直接提取法適用于維生素預混合飼料中的維生素E(dl-α-生育酚)的測定,定量限為20mg/kg。其原理為維生素預混合飼料中的維生素E(dl-α-生育酚)用甲醇溶液提取,試液注入高效液相色譜分析柱,用紫外檢測器在285nm波長條件下測定,外標法計算維生素E(dl-α-生育酚)的含量。1.4維生素K3的含量測定方法單體維生素K3是外觀呈白色或灰黃褐色的晶體粉末。根據《GB/T18872—2002飼料中維生素K3的測定高效液相色譜法》可進行維生素K3的真偽判別。該標準主要參考《美國全國飼料協會(NFIA)分析方法概要》發表的方法《高效液相色譜法(HPLC)測定全價飼料、預混料和維生素濃縮制劑中的維生素K3》而制定。適用于配合飼料、濃縮飼料、復合預混合飼料和維生素預混合飼料中維生素K3(亞硫酸氫鈉甲萘醌)的測定。測量范圍為維生素K3含量在2.0mg/kg以上。其原理為用三氯甲烷氨溶液提取維生素K3并轉化成游離甲萘醌,蒸發三氯甲烷,殘渣溶解于甲醇中。用高效液相色譜測定,維生素K3(甲萘醌)經