第五章載體

目前所用的載體有：

質(zhì)粒

酵母質(zhì)粒

噬菌體載體

病毒載體

粘粒

酵母人工染色體

按功能分為:克隆載體,表達載體

第一節(jié)質(zhì)粒（plasmid）

一．什么是質(zhì)粒

[質(zhì)粒]染色體外能獨立復(fù)制，能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子。

二．質(zhì)粒的基本性質(zhì)、分類和命名

1．質(zhì)粒的分布、大小和數(shù)目

分布：細菌、酵母、霉菌和某些真核細胞

大?。?06-2

810Dalton

例子：F1：6.2

106

ColE1:4.2

106

R64:7.8

106:

四環(huán)素，鏈霉素抗藥性

質(zhì)粒的理化性質(zhì)

具有一般核酸分子的理化性質(zhì)

質(zhì)粒的生物學(xué)特性

寄生性──質(zhì)粒只能在宿主的細胞內(nèi)復(fù)制

穩(wěn)定性──每種質(zhì)粒在寄生蟲細胞中總有

一定的拷貝數(shù)

同源性──不同質(zhì)粒之間可能存在一定的

同源區(qū)。

重組性──兩種不同的質(zhì)粒處于同一宿主細胞

中或者一種質(zhì)粒處于同一宿主中，

有可能發(fā)生質(zhì)粒與質(zhì)粒之間或質(zhì)粒

與染色體之間的重組

不相容性──有相同復(fù)制起始區(qū)的不同質(zhì)粒不

能共存于同一宿主細胞

傳遞性──有些質(zhì)粒在細菌間能夠傳遞、具有

轉(zhuǎn)移性的質(zhì)粒帶有一套根轉(zhuǎn)移有關(guān)

的基因。消除性──存在于宿主細胞中的質(zhì)粒，可用

某些辦法將它除掉。

復(fù)制類型──松馳型質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主

細胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制。

表現(xiàn)型──不同的質(zhì)粒有不同的表型特性。質(zhì)粒的分類

按表型效應(yīng)分：

①和質(zhì)粒有關(guān)的性狀是多方面的

②質(zhì)粒能控制宿主的遺傳性狀─載體

③一種細菌可以具有不止一種表型效應(yīng)

如：a．大腸桿菌的致育的因子（F）

b.大腸桿菌素因子（COlE1）抗藥性質(zhì)粒（R）

分解性質(zhì)粒：假單孢菌中發(fā)現(xiàn)，如分解

樟腦的質(zhì)粒

特殊性質(zhì)質(zhì)粒：致瘤膿桿菌的質(zhì)粒，寄

主植物莖部長瘤狀突起

隱秘性質(zhì)粒：沒有表型效應(yīng)按拷貝數(shù)分

嚴(yán)緊型松弛型

轉(zhuǎn)移類型：

1.轉(zhuǎn)移型（接合轉(zhuǎn)移）如：F因子

2.非轉(zhuǎn)移型如：ColE1

不親和群：可在同一細菌中共存的，

為不同不親和群

命名

用小寫字母p代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q

如：pBR322，字母p代表質(zhì)粒，

BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表…構(gòu)建的一系列質(zhì)粒的編號。

質(zhì)粒的分離和純化

細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增

細菌的收集和裂解

質(zhì)粒DNA的純化

理想質(zhì)粒載體所必需具備的條件

1.質(zhì)粒較小

低分子量的質(zhì)粒通?？截悢?shù)較多克隆時所預(yù)期的基因表物的數(shù)量較大有可能找到合適的單一限制酶切點，便于制作酶譜外源DNA容量較大,質(zhì)粒小容易轉(zhuǎn)化（大于15kb時，成為轉(zhuǎn)化效率制約因素)操作容易掌握，容易分離，不易斷裂

2.帶有可供選擇的標(biāo)記

對抗菌素的抗性，Amp,Tet,Cm,Kana,Neo,

互補

3.帶有盡可能多的單一限制性酶切位點

單一的限制性酶切位點可供外源DNA定點插入；較多不同的單一限制酶酶切位點，可有選擇地供帶有不同末端的外源基因插入

4.具有復(fù)制起始點

質(zhì)粒DNA增殖所必不可少的結(jié)構(gòu)。

5.作為表達載體，還要有啟動子和終止子序列等片段人工組建的克隆載體

pBR322

歷史：最早載體質(zhì)pSC101,ColE1,pCR1──復(fù)制效率低

沒有選擇標(biāo)記

沒有2個以上克隆位點

pBR322,──松弛復(fù)制，Tet和Amp抗藥性，一些有用的RE切點太大，一半序列非必需

pBR322,去除非必需序列，

4.36kb現(xiàn)在的質(zhì)粒多為其直系后裔

構(gòu)建：ColE1復(fù)制區(qū)+pSC101.TcR基因+Tn3AmpR基因

特點：

應(yīng)用：生長激素釋放抑制因子的表達

pUC系列

pUC18/pUC19（2.69kb）

pUC118/pUC119（3.2kb）

一互補原理篩選

用途：

（1）克隆載體藍白篩選

(2）DNA序列分析

118/119帶有M13噬菌體的DNA合成、終止包裝序列帶質(zhì)粒菌+M13K07輔助噬菌體產(chǎn)生SS.DNA,用于測序，體外誘變，鏈特異探針合成

（3）基因表達載體融合蛋白

第二節(jié)噬菌體類運載體

目前使用的噬菌體類運載體系主要有：

噬菌體衍生物

柯斯質(zhì)粒（Cosmid）

M13噬菌體

噬菌體運載體

噬菌體的基本特點：

生活史

DNA結(jié)構(gòu)：

雙鏈，基因組大小為48.kb,線狀兩端帶有單鏈12kb的互補末端，稱為粘性末端

從J基因到N基因部份包含有功能不清的b2基因段以及與重組、整合和切離等溶源化有關(guān)的基因。

DNA長度不超過野生型DNA長度（48.6kb）的75~105%范圍進行包裝

噬菌體運載體

改造野生型

DNA：突變/缺失等手段消除過多的酶切位點及非必需區(qū)在非必要區(qū)插入外源基因（如lacZ基因）

改變噬菌斑的顏色、濁度等，以利篩選

插入型載體：

改造后使

DNA分子的中心僅有幾個單一酶位點插入外源DNA片段，如

gt10

可克隆10kb外源片段

置換型載體：基因組中間部分約三分之一的基因組可以用外源基因進行替換，從而擴大載體的裝載容量，如EMBL系列可克?。?kb外源片段

．

粘粒（Cosmid）

粘粒是用基因工程技術(shù)組建的大腸桿菌質(zhì)粒具有：

a．

噬菌體的Cos位點

b.整個pBR322的DNA順序

c.可容納35──45kb外源DNA

d.有抗性標(biāo)記及多種限制性酶單切點

e.經(jīng)感染進入細菌細胞以后，像質(zhì)粒那樣在細胞中復(fù)制

f.可以體外包裝成噬菌體顆粒，以感染方式進入宿主細避開了大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化因難的缺點

M13噬菌體運載體

M13是一種細線狀的單鏈DNA噬菌體，在分子生物學(xué)研究中主要用于DNA的堿基順序分析。

M13的生物學(xué)特性

M13只感染帶有F+因子的雄性細胞（JM101，JM103等）

其DNA為環(huán)狀單鏈分子，有6407個堿基組成。

生活史

M13載體的構(gòu)建

M13DNA中有507個核苷核（3948～60