葡萄糖測定的不確定度評定

檢測方法的選擇血清中葡萄糖的含量是人體健康的重要指標(biāo)?？崭轨o脈血漿血糖濃度低于3.33～3.89mmol/L時稱為低血糖,而超過7.80mmol/L時稱為高血糖。血糖含量測定是臨床檢驗中最重要的指標(biāo)之一,它可為糖尿病、高血壓以及心腦血管系統(tǒng)等疾病的診斷、療效觀察、病程檢測、疾病預(yù)防等提供客觀依據(jù)。目前,血清葡萄糖常用的檢測方法主要有葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法、微電流法、氧速率法、己糖激酶法(HK法)、氣相色譜/同位素稀釋質(zhì)譜法(GC-ID/MS法)等。其中,ID/MS是微量、痕量和超痕量物質(zhì)含量的權(quán)威測量方法。HK法、GOD-POD法與GC-ID/MS法相比較,血糖濃度在5.6～10mmol/L時相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為19.27%、19.20%和1.65%,10mmol/L以上時相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為27.31%、24.19%和2.24%?？梢奊C-ID/MS法測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差遠遠小于另兩種方法。本文通過向樣品溶液中加入同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)物,利用GC-MS測定標(biāo)記物與溶質(zhì)的峰強度比來測定溶質(zhì)的濃度。該法特異性高、準(zhǔn)確度好。1實驗部分1.1化學(xué)試劑及儀器冰凍混合人血清,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所;D-葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)品,純度為99.8%,美國Amersco公司;D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物,同位素豐度大于99.9%,英國CambridgeIsotopeLaboratories,Inc;疊氮化鈉,分析純,德國Merck公司;鹽酸羥胺,分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;吡啶,分析純,美國TEDIA公司;乙酸酐,分析純,北京化工廠;二氯甲烷,色譜純,德國Riedel-deHa?n公司;乙酸乙酯,分析純,天津市津科精細化工研究所;無水乙醇,分析純,美國JTBaker公司;實驗用水為高純?nèi)握麴s水(Millipore,0.22μm)。ThermoFinniganDSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國熱電公司;MettlerToledoUMX2天平,瑞士梅特勒公司;TouchMixerMT-51渦旋振蕩器,日本Yamato公司;BF-2000A氮氣吹干裝置,八方世紀公司;LD5-2A離心機,北京醫(yī)用離心機廠。1.2樣品樣品制備1.2.1葡萄糖標(biāo)記物純度精確稱取一定質(zhì)量的D-葡萄糖純度標(biāo)準(zhǔn)品、D-[13C6]葡萄糖標(biāo)記物純度標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定體積0.1%疊氮化鈉溶液中,使各自質(zhì)量分數(shù)與血清中葡萄糖質(zhì)量分數(shù)初測值接近,分別約為1.15×10-3和1.38×10-3。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,移取體積一定的葡萄糖標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入至一定體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,保證二者濃度比例范圍約為(0.95,1.05),輕搖混勻、充分平衡。1.2.3葡萄糖標(biāo)記物的添加量待血清樣品室溫平衡后,根據(jù)血清樣品中葡萄糖的大致濃度,向樣品中加入一定體積的葡萄糖標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)溶液,輕搖、在4℃冰箱平衡過夜,使血清樣品中葡萄糖與添加的葡萄糖標(biāo)記物二者濃度比例范圍約為1∶1。1.3鹽酸羥胺的合成向已添加標(biāo)記物的樣品中加入1mL無水乙醇,振蕩混勻,在4℃下以5000r/min離心10min除去蛋白,取上層清液,過0.22μm有機濾膜,60℃下N2吹干。加入400μL鹽酸羥胺的吡啶溶液,90℃下反應(yīng)30min。冷卻后,再加入600μL乙酸酐,90℃下反應(yīng)60min。冷卻,加入1.5mL水和0.5mL二氯甲烷,充分振蕩、靜置10min以上,取下清液50℃下N2吹干,加入150μL乙酸乙酯復(fù)溶,移至色譜分析瓶中。將校準(zhǔn)比值混合溶液60℃下N2吹干,處理方法同前。將樣品進行GC-ID/MS分析。1.4分析1.4.1初始溫度和進樣方式DB-1701毛細管色譜柱30m×0.25mm×0.25μm(膜厚),載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),流速1.5mL/min。柱溫初始溫度125℃,以20℃/min速率升溫到180℃,再以5℃/min速率升溫到280℃,保持20min。進樣方式為不分流;進樣量1μL,進樣口溫度270℃。按低標(biāo)→樣品A→樣品B→高標(biāo)的進樣次序進樣,要求相鄰兩次進樣的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%,否則需要再增加進樣次數(shù),直至滿足要求。1.4.2離子監(jiān)測電離方式為電子轟擊電離源(EI),電離能量70eV。離子源溫度250℃,傳輸線溫度:270℃,溶劑延遲3min。儀器分辯率1000;發(fā)射電流0.2mA;采集方式SIM(選擇離子監(jiān)測);掃描時間為20ms,間隔5ms,雙通道,m/z314和m/z319。1.5brhl1mserps1樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的濃度比和響應(yīng)峰面積比在兩個校正標(biāo)準(zhǔn)之間符合線性關(guān)系,血清中葡萄糖的質(zhì)量濃度可按括弧法計算C=[(Rs?R1)(Wh?W1)+W1]Mlab(Rh?R1)MserPs(1)C=[(Rs-R1)(Wh-W1)+W1]Μlab(Rh-R1)ΜserΡs(1)其中C為待測血清樣品中的葡萄糖質(zhì)量濃度,mg/kg;Rs、Rl、Rh分別為血清、低標(biāo)、高標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比;Wh、Wl分別為高標(biāo)、低標(biāo)樣品中葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的質(zhì)量比;Mlab、Mser分別為加入血清樣品標(biāo)記的、待測血清樣品中的葡萄糖的質(zhì)量,g;Ps為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的純度,99.8%;通過測定葡萄糖與標(biāo)記葡萄糖的峰面積比,計算血清樣品中葡萄糖的準(zhǔn)確含量。2結(jié)果與討論2.1血清樣品檢測圖1、圖2列出了血清樣品的選擇離子掃描色譜圖和質(zhì)譜圖,從圖1中可以看出,葡萄糖及同位素的保留時間為10.09min,響應(yīng)約為1.01×105。表1、表2分別為取5瓶低標(biāo)和6瓶高標(biāo)血清樣品,每瓶取2個平行樣,每個樣進2針取平均值。測得低標(biāo)、高標(biāo)血糖濃度分別為1150mg/kg、1396mg/kg,即9.86mmol/L、11.97mmol/L,高于糖尿病所規(guī)定濃度下限(7.8mmol/L),即所測兩種樣品均為糖尿病人血清。2.2質(zhì)譜性能不穩(wěn)定測量結(jié)果的不確定度包括隨機因素和非隨機因素產(chǎn)生的不確定度,計算結(jié)果如表3所示。測量結(jié)果的不確定度,與如下因素有關(guān):(1)檢測儀器的性能,包括精密度、靈敏度、誤差。在實驗過程中,質(zhì)譜性能不穩(wěn)定常引起結(jié)果波動較大,主要體現(xiàn)在樣品瓶內(nèi)偏差呈增大趨勢,采用GC-ID/MS相對于LC-ID/MS更加穩(wěn)定。(2)樣品前處理過程復(fù)雜,化學(xué)衍生反應(yīng)受多種因素影響。為準(zhǔn)確檢測樣品中葡萄糖的含量,需確保樣品中的葡萄糖完全被衍生化。(3)加樣的準(zhǔn)確性對數(shù)據(jù)的重復(fù)性有直接影響。實驗過程中,由于使用高精度的天平稱量樣品,加樣時使用電動移液器,重復(fù)性較好,減小了人為操作引起的