高效液相色譜法測(cè)定尿中

苯二甲酸（tpa）是世界上最常見(jiàn)的生產(chǎn)和利用材料之一。它主要用于生產(chǎn)結(jié)晶、脂肪和聚酯纖維。目前，中國(guó)的生產(chǎn)和使用也非常廣泛。常用的TPA檢測(cè)主要是分光光度法,由于其靈敏度和特異性均較低,不能適應(yīng)生物材料的檢測(cè)。近年來(lái)的研究結(jié)果表明進(jìn)入體內(nèi)的TPA主要以原形經(jīng)尿排出體外。尿中TPA的變化基本上能反映出體內(nèi)TPA的吸收與排泄情況。因此,我們研究了采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定接觸工人尿中TPA的含量的方法,以期達(dá)到為接觸人群TPA生物學(xué)臨測(cè),TPA毒理學(xué)研究及TPA的職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供方法和依據(jù)。1材料和方法1.1儀器Waters高效液相色譜儀,配備510泵、996二極管矩陣檢測(cè)器、2010色譜工作站。1.2成品白砂糖TPA對(duì)照品(純度99.99%),由中國(guó)揚(yáng)子石化總公司提供,用1%氫氧化鈉溶解制1mg/ml的貯備液備用,氯化四丙胺(純度99%),Sigma化學(xué)公司產(chǎn)品,用去離子水溶解制成5mM的溶液備用,甲醇,色譜純,江蘇省淮陰精細(xì)化工廠生產(chǎn);醋酸乙酯,分析純,南化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。1.3無(wú)tpa接觸史個(gè)體選擇某大型企業(yè)接觸TPA粉塵的作業(yè)工人群,工人留取當(dāng)天工前工后尿樣,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?對(duì)照組為無(wú)TPA接觸史的同單位行政工作人員。1.4方法1.4.1流動(dòng)相bondpak色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱,粒度10μm,規(guī)格4.6250mm不銹鋼柱(μBondapakC18);流動(dòng)相:甲醇-5mM氯化四丙胺水溶液(1∶9v/v)(ph760);流速1.5ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):238nm。1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取等份的無(wú)TPA接觸史人員的尿樣若干份,每份2ml,加入不同量的TPA對(duì)照品溶液,制成含TPA濃度分雖為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μg/ml標(biāo)準(zhǔn)系列,分加0.2ml10%高氯酸溶液,混勻,分別精密加入2ml醋酸乙酯渦流混旋萃取1min,緩慢加入0.1ml無(wú)水乙醇后靜置分層,精密吸取上層清液1ml置5ml具塞離心管中,置60℃水浴中用氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?.5ml無(wú)水乙醇溶解,取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,測(cè)定TPA峰峰面積,以TPA的濃度為自變量(x),以TPA峰峰面積為自變量(X)的函數(shù)(Y),計(jì)算TPA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。Y=19397.4406X-3306.6124;相關(guān)系數(shù)r=0.9997;線性范圍0.1—20μg/ml。1.4.3尿樣中tpa的含量測(cè)定精密吸取解凍尿樣2ml,置5ml具塞離心管中,加0.2ml10%高氯酸溶液,混勻,照TPA標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的步驟,測(cè)定尿樣中TPA峰峰面積,并代入TPA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算尿樣中TPA的含量。2結(jié)果與討論2.1不同ph下醋酸乙酯對(duì)尿樣萃取效率的影響精密吸取等份的加標(biāo)尿樣(含TPA5.0μg/ml)若干份,每份2.00ml,置5ml具塞離心管中,分別用10%高氯酸和0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)各樣品的pH值分別為0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、8.0、10.0分別用2.0ml醋酸乙酯萃取1min,照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的步驟測(cè)定每份尿樣中TPA的含量,并計(jì)算不同pH時(shí)的萃取效率,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示pH在1～3范圍內(nèi)TPA的提取效率最高,相應(yīng)10%高氯酸用量為0.1～0.3ml,將10%高氯酸用量控制為0.2ml。2.2提取溶劑的確定精密吸取等份的加標(biāo)尿樣(含TPA5.0ug/ml)若干份,每份2.00ml,置5ml具塞離心管中,加入0.2ml10%高氯酸溶液,混勻,分別用1ml正已烷,環(huán)己烷,三氯甲烷,二氯甲烷,石油醚,正丁醇,醋酸乙酯渦流混旋萃取1min,照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的步驟測(cè)定每份尿樣中TPA的含量,并計(jì)算每種溶劑的提取效率,結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,在所用的溶劑中醋酸乙酯的提取效率最高,達(dá)98.67%。2.3酯酸乙酯萃取精密吸取等份的加標(biāo)尿樣若干份,每份2.00ml,置5ml具塞離心管中,分別加入0.2ml10%高氯酸溶液,混勻,分別用酯酸乙酯萃取:2ml×1,2ml×2,2ml×3。合并萃取液于具塞離心管中,置60℃水浴中用氮?dú)獯蹈?照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的步驟測(cè)定每份尿樣中TPA的含量,并計(jì)算不同萃取次數(shù)的提取效率,結(jié)果見(jiàn)表3.結(jié)果提示無(wú)論是較高(10μg/ml)或較低濃度(5μg/ml)的TPA尿樣,醋酸乙酯的提取次數(shù)對(duì)尿中TPA的提取效率均不存在明顯的差異。2.4加標(biāo)回收率測(cè)定精密吸取等份的無(wú)TPA接觸史人的尿樣若干份,每份2.00ml,置5ml具塞離心管中,準(zhǔn)確加入TPA對(duì)照品適量,混勻后分別加入0.2ml10%高氯酸溶液,混勻,照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的步驟測(cè)定每份尿樣中TPA的含量,根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算測(cè)定方法的回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明該方法的測(cè)定回收率為98.80%±4.23,變異系數(shù)(RSD)為42.8%。2.5高效液相色譜法利用本法測(cè)定56名接觸工人工前、工后尿TPA含量,同時(shí)測(cè)定尿肌酐(Cr)的含量,以此校正尿TPA的含量,結(jié)果分別為5.69±2.91mmol/molCr、15.87±5.97mmol/molCr,對(duì)照組尿TPA未檢出。文獻(xiàn)報(bào)道尿樣稀釋后直接測(cè)定,靈敏度相對(duì)較低,僅適用于高濃度尿TPA含量的測(cè)定。本方法采用醋酸乙酯萃取法,提高了TPA含量測(cè)定的靈敏度,方法的特異性好,具有較寬的線性范圍,在0