牛羊超數(shù)排卵方法的研究進展

超數(shù)抗卵（超數(shù)抗卵）可以誘導大量成熟的卵，增加移植胚胎的數(shù)量，這對動物育種中起著重要作用。同時，它也是研究動物生產和動物克隆的基本手段之一。目前家畜的超排主要用于牛羊，以使用FSH或PMSG為主。也有人在試驗通過抑制素免疫進行，效果明顯，但超排個體反應差異較大，這一問題目前仍無法解決。本文就牛羊超排方法的研究進展進行綜述，以使人們對超排有更多了解，促進超排方法的改進，超排效果的提高。1局部的超排處理初級卵泡經過征集、選擇、優(yōu)勢化，而發(fā)育到可排卵階段，其間絕大多數(shù)卵泡（如反芻動物99%以上）的命運是閉鎖退化。超排處理就是降低發(fā)育卵泡的閉鎖率，增加早期卵泡發(fā)育到高級階段的數(shù)量，是一個連續(xù)的動態(tài)過程，這一過程受中樞神經系統(tǒng)、垂體前葉和卵巢間激素調控。超排處理常見的方法有：(1)降低或消除卵巢對促性腺激素釋放的負反饋反應，這主要針對FSH，如進行抑制素免疫。(2)增加外源激素，提高血液中促性腺激素濃度。生產中較多采用后者，而且常與刺激內源促性腺激素釋放的方法結合進行。1.1fsh劑量的確定以發(fā)情當天為0d，在發(fā)情周期的適當時間，即卵泡波發(fā)生時（12～13d或17～18d），開始肌注或皮下注射FSH，以遞減劑量或恒量連續(xù)注射3d6次或4d8次，即每天2次，間隔12h。FSH總劑量按牛、羊的體重、胎次作適當調整：羊一般為150～300IU，牛略高。FSH注射完后隨即進行試情。1.2肌注hcg200在發(fā)情周期的適當時間（發(fā)情周期12～13d或16～18d），羊一次性肌注或皮下注射PMSG800～1500IU，出現(xiàn)發(fā)情后或配種當天肌注hCG500～750IU。牛按每千克體重5IU左右確定PMSG的總劑量，在注射PMSG后48h和60h各肌注PG一次，劑量0.2～0.4mg，在出現(xiàn)發(fā)情后12h即第1次輸精的同時肌注抗PMSG。2民事成本低，易導致應激目前，困擾超數(shù)排卵效果有2個主要因素：超排反應變異范圍大和黃體早期退化。與FSH相比，PMSG省時、省力、成本低，但有副作用；FSH雖然副作用小，但要求多次注射，較麻煩，對供體造成的應激較大，成本也較高。針對這些問題，人們主要就如何在最大程度發(fā)揮PMSG、FSH作用的前提下，盡可能減少或消除它們的缺點做了較多的探索改進。2.1大量應用pmsg的安全性因素PMSG是最初在山羊的胚胎移植的科研和生產中廣泛應用的超排激素，早在1983年，Armstrong就曾用PMSG對山羊進行超排，一次注射750～1250IU，平均獲胚10.8±1.2個。1985年Durant給山羊一次注射PMSG500IU，取得了同樣的效果。但是用PMSG超排時，由于PMSG半衰期比較長，且具有FSH和LH兩重作用，因此大量應用PMSG處理時會帶來一些副作用，如：容易造成卵巢腫大，不排卵的卵泡增多，使雌二醇(E2)分泌增多造成胚胎發(fā)育早期，外周血中高E2水平，形成不利于早期胚胎發(fā)育的雌激素主導的子宮環(huán)境。使發(fā)育中的胚胎質量下降，并能使黃體早期退化，而使胚胎回收率下降。Pintado等(1998)于撤去孕酮陰道栓前第36h注射1000IUPMSG，在撤栓后的第28h靜脈注射PMSG抗體，得到的可用胚數(shù)比對照組(僅用PMSG)幾乎增加1倍(5.75:2.75;p<001)。但排卵平均增加不明顯，可能是個體差異的原因。Saharrea等(1998)在山羊發(fā)情開始后84h給予hCG，有力地阻止了PMSG超排引起的黃體早期退化。但試驗表明,用FSH進行超排處理在排卵率、受精率、優(yōu)質胚產量上要優(yōu)于PMSG。因此,現(xiàn)在生產中已經較少使用PMSG進行超排，一般使用FSH。2.2fsh和pmsg的超排效果此法是將同期發(fā)情和超數(shù)排卵結合在一起的方法，是目前使用最多的牛羊超排方法。其具體操作是給供體在陰道內放入第1個CIDR10d后取出，同時放入第2個CIDR,5d后開始注射FSH，或給供體放入第1個CIDR后9～10d開始注射FSH，連續(xù)遞減劑量注4d8次，在第7次注射FSH時取出CIDR，并同時注射PG，一般取出CIDR后24～48h發(fā)情。Amstrong的試驗中，用FSH處理山羊后平均排卵數(shù)為16.1±0.8個，顯著高于一次性注射PMSG處理后的平均10.8±1.2個。Kiessling等(1986)對奶山羊進行了FSH和PMSG超排對比試驗，F(xiàn)SH超排獲得胚胎數(shù)為17(n=2)枚，明顯超過了PMSG處理組獲得的2(n=2)枚。因此近年來，此種方法的應用較PMSG要多。FSH的超排效果雖然優(yōu)于PMSG，但因其半衰期短，必須進行多次注射才能起作用，程序繁瑣。為了簡化FSH的注射程序、降低動物的應激反應，有人將其溶于大分子聚合物聚乙烯吡咯酮(PVP)中，進行1次性的肌肉注射。由于PVP是大分子聚合物，用其作為FSH的載體，和FSH混合后注射，可使FSH緩慢釋放從而延長FSH的作用時間，一次性注射FSH即可達到超排的目的。研究表明，F(xiàn)SH制劑用PVP溶解進行一次注射超排時，其在母牛體內的半衰期可延長到大約3d，而溶解在鹽水中的FSH半衰期僅為5h左右。Smith等（1973）最早將此法用于肉牛的超排，以后許多學者對此方法進行了研究和改進。Yamamoto等將30mgFSH溶于10mL300g/LPVP中，一次肌注對牛進行超排獲得良好效果。曾培堅（1997）報道，分別用7.5mg(中科院動物所生產)、250IU、300IU(武漢生物制藥廠生產)FSH溶于10mL15%PVP中進行一次性注射超排綿羊，頭均獲胚分別為5.0、4.67和5.0枚。李鍵等用30%PVP溶液稀釋FSH后一次注射總劑量超排處理波爾山羊與FSH遞減法多次注射對比，分別獲得可用胚22±1.0枚和19.0±11.1枚，差異不顯著。試驗表明，將FSH溶于PVP載體中一次注射，可用于家畜的超排，但PVP的最佳分子量和濃度等，有待進一步試驗研究。2.4發(fā)情周期的fsh作預處理Waer等在發(fā)情后的第2d或第3d給青年母牛10mgFSH作預處理，隨后在11～16d再進行總量為35mgFSH正常處理，結果預處理青年母牛平均排卵3.5枚，對照組為2.1枚。Rejamahendran等在發(fā)情周期的第3d和第4d給予2.5mgFSH作預處理，結果比正常FSH程序回收到的卵子多（P<0.05），每頭母牛回收的優(yōu)質胚胎增加1.6枚。但Lussier等（1989）試驗表明排卵數(shù)并未提高。一般供體牛在放入CIDR后第9d開始注射FSH進行超排。耿繁軍等在放入CIDR的同時肌注5mg17β-E2后的4d后就進行超排，結果獲得可用胚數(shù)和A級胚胎數(shù)與一般方法差異不顯著，但使超排全過程時間縮短，相應的在胚胎移植過程中受到天氣變化等不利因素的影響程度減小，可操作性相對增強。2.6外源性fsh對fshs人工模型的影響王志剛等（1999）用He-Ne激光照射穴位結合外源性FSH處理牛，增加了胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)，試驗組頭均胚胎數(shù)比對照組多2.2枚，頭均可用胚數(shù)比對照組多1.9枚,差異顯著。2.7超排使用fsh的必要性Gong等(1996)在青年母牛上，用重組的牛生長激素(rbGH/rBST)增加了有腔卵泡(2～5mm)的數(shù)量，增強了對eCG的超排反應，胚胎回收的最終結果顯示，rbGH預處理顯著提高了母牛的排卵數(shù)、胚胎回收率與可移植胚數(shù)量，可用胚率明顯增加。另外，卵巢囊腫等排卵反應差現(xiàn)象發(fā)生率顯著低于對照組。在綿羊上，Joyce等(1998)發(fā)現(xiàn)，用FSH超排處理前使用生長激素(rGH)啟動的預處理方法，改變了產雌激素大卵泡IGF(類胰島素生長期因子)系統(tǒng)，使卵巢上中等大小的卵泡生理性成熟度及數(shù)目增加，但未改變排卵率反應。Akinlosotu等(1993)對山羊用FSH進行超排時，在發(fā)情開始時給予一定量的GnRH可以減少胚胎回收時不排卵大卵泡數(shù)量的出現(xiàn)，結果不但提高了胚胎質量,而且提高了可移胚數(shù)和受孕率。Fry等(1999)在牛的試驗中報道:超排時，用促性腺激素刺激72h后，給予一定量的GnRH大大增加卵巢上d≥5mm的卵泡數(shù)量，提高了超排效果。桑潤滋等在牛發(fā)情輸精同時注射LRH，結果可用胚率比對照組高21.6個百分點，差異極顯著。也有人采取PMSG和FSH相結合的方法，用PMSG代替部分FSH進行超排處理。岳奎忠等(2000)于第1次注射FSH的同時，加注PMSG200IU。超排母羊的平均紅體數(shù)為13.94±1.11個，平均獲卵10.59±0.97個，獲卵率為78.20%，顯著超過了單純使用FSH處理。Pintado等(1998)用PMSG替代部分FSH，獲得了和單純使用FSH一樣數(shù)量的可用胚，大大降低了超排的成本。2.10疫羊兩組小鼠統(tǒng)計結果比較有人嘗試用人工合成的抑制素免疫法對羊進行超排試驗。Wheaton等（1992）用高度純化的抑制素抗血清主動免疫綿羊，排卵率較對照組提高3.3倍。桑潤滋等（2000）也用抑制素免疫母牛，并結合純化FSH，超排結果，試驗組頭均胚胎數(shù)和頭均可用胚數(shù)分別比對照組增加2.4枚和1.4枚。大量的事實表明,供體進行抑制素免疫后，所產生的抗體中和了外周血漿中的抑制素，減弱了其對垂體的負反饋作用，從而使FSH分泌增加，促進卵泡發(fā)育并提高了排卵率。3激素超排技術應用同一種超排方法，不同的個體之間超排結果差異較大，除了個體本身的因素外，激素的應用也起著很大的作用。激素劑量過大，卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)和排卵數(shù)量過多，會導致卵巢體積的異常增大和卵子接受過程的機械障礙，經輸卵管傘接受到的卵子數(shù)量卻有限。劑量不足，則達不到預期的超排效果。楊梅等(2003），桑潤滋等(2003）等多人對激素的最佳劑量進行了研究，但由于激素的生產廠家、生產批號不同，供體的狀況也有差別，因此不能得到統(tǒng)一的標準。Moor等(1984)提出，激素制劑中FSH/LH的比例在刺激卵巢反應中起著重要作用。Amstrong等(1984)用FSH/LH比例最低的FSH制劑對綿羊和山羊進行超排，結果超排率和胚胎產量提高。激素注射途徑的不同也影響著供體的超排反應。在羊上，肌注LH或hCG時，促排反應慢且排卵同期化較差；而靜脈注射時，激素作用快，羊排卵同期化好，而且靜注比肌注激素用量要少。俞頌東等(2002)報道激素肌注部位選在臀部的效果明顯好于頸部。供體超排后配種時是否需要注射hCG或LH促進排卵，對此看法尚不一致。Hafez認為，成年母牛、綿羊和山羊不需要外源性LH或hCG。王光亞也同意這種觀點，他的試驗顯示，山羊超排后能表現(xiàn)發(fā)情，內源性的LH足以誘導大多數(shù)卵泡的排卵，增加外源性的LH似乎不能提高超排效果。但也有大量的報道稱在超排時注射LH或hCG可提高超排效果。本實驗室曾對此進行了研究，表明在肉羊配種時注射LH，使血液中LH濃度增加，可以增加獲胚數(shù)，減少未排卵