對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌活性研究

氨基丙烯酸的外殼聚糖酯具有與尼泊金酯相似的結(jié)構(gòu)，可以預(yù)測(cè)尼泊金酯具有類似的抗菌能力。由于其結(jié)構(gòu)比尼泊金酯復(fù)雜，本研究系統(tǒng)地研究了氨基丙烯酸殼聚糖酯的抗菌性能。目前，最高理論抗菌率a、最小細(xì)菌濃度mic和生長(zhǎng)適應(yīng)性t的適應(yīng)性來反映腐敗機(jī)構(gòu)的抗菌活性，抗菌率i、衰減系數(shù)t和最終階段t的半衰期可以反映腐敗機(jī)構(gòu)抗菌活性的穩(wěn)定性和穩(wěn)定性。對(duì)此，本文測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)各種微生物的抑菌性能，從而獲得了其抗菌譜，并與目前常用的尼泊金酯(丙酯和丁酯)的抑菌活性進(jìn)行比較；繪制對(duì)細(xì)菌、酵母和霉菌的生長(zhǎng)抑制曲線，得到了防腐劑的抑菌率和抑菌性能指標(biāo)；研究了pH值和加熱處理對(duì)其抗菌活性的影響；最后進(jìn)行了防腐劑在果汁和肉汁保藏中的實(shí)際應(yīng)用，為其在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。1材料和方法1.1羥基苯甲酸殼聚糖酯的制備牛肉浸膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂(生化試劑)；葡萄糖、氯化鈉(AR)；麥芽汁自制；對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯自制；對(duì)羥基苯甲酸丙酯(尼泊金丙酯，propylp-Hydroxybenzoate)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(尼泊金丁酯，butylp-Hydroxybenzoate)江蘇昆山華新日用化學(xué)品有限公司。1.2儀器和檢測(cè)儀器LDZX-40A立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；RE52-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海滬西分析儀器廠；ST-250-A生化培養(yǎng)箱南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；SW-CJ-1F醫(yī)用潔凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV2000紫外可見光光度計(jì)尤尼可(上海)儀器有限公司；SHY-2A恒溫水浴振蕩器金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。1.3方法1.3.1假絲酵母本菌株細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和大腸桿菌(Echerichiacoli)；酵母：啤酒酵母(Sacchaomycescerevisiae)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candidauilis)；霉菌：黑曲霉(Aspergillumniger)和桔青霉(Peniciliumcitrinum)。以上菌種分別由江南大學(xué)食品學(xué)院和江蘇省微生物研究所提供。1.3.2培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)酵母和霉菌用)。1.3.3酵母和霉菌培養(yǎng)預(yù)先將7種供試菌種接入相對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，酵母和霉菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。分別挑取1環(huán)已活化好的菌種放入9ml無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度約為107CFU/ml供試。1.3.4培養(yǎng)基的制備用2倍稀釋法配制得到各種濃度對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯溶液，分別用無菌吸管定量將該溶液加入至已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后分別加入一定體積已熔化并降溫至45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，加入0.1ml含菌量為107CFU/ml的菌懸液，涂布。細(xì)菌在37℃倒置培養(yǎng)24h，霉菌和酵母在28℃恒溫培養(yǎng)48h，從無菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿中找出MIC的培養(yǎng)皿，此皿的防腐劑濃度即為防腐劑的最低抑菌濃度(MIC)。1.3.5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是光學(xué)法檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時(shí)期的大腸桿菌細(xì)胞每20min分裂一次。將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長(zhǎng)速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長(zhǎng)曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長(zhǎng)曲線也不相同。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，了解其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，這對(duì)于人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細(xì)菌的生長(zhǎng)具有重要意義。用分光光度法進(jìn)行光電比濁測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。選擇金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、啤酒酵母和黑曲霉進(jìn)行以下討論。1.3.5.細(xì)菌數(shù)量測(cè)定稱取一定量的對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯，用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度，調(diào)整pH值為7.0，接入濃度為107CFU/ml0.5ml的細(xì)菌菌種液，以不加對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的培養(yǎng)基混合液作為空白對(duì)照，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定其吸光度值，用吸光度值的變化反映濁度的變化，也就是細(xì)菌數(shù)量的變化。1.3.5.羥基苯甲酸殼聚糖酯麥芽汁固相萃取能力測(cè)定稱取一定量的對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯，用麥芽汁培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度，調(diào)整pH值為7.0，接入濃度為107CFU/ml0.5ml的啤酒酵母菌液，以不加菌液的對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯麥芽汁培養(yǎng)基混合液作為空白對(duì)照，置于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定其吸光度值。1.3.5.黑曲霉芽孢桿菌的培養(yǎng)稱取一定量的對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯，用麥芽汁培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度(最低抑菌濃度)，調(diào)整pH值為7.0，接入濃度為107CFU/ml0.5ml的黑曲霉孢子懸浮液，在30℃培養(yǎng)，定時(shí)取樣，用布氏漏斗抽濾。收集菌絲體，洗凈，置烘箱中烘干后稱重。1.3.6稀釋液的稀釋最低抑菌濃度(MIC)常用來表示防腐劑抑菌效果的指標(biāo)，但是最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)只能幫助確定防腐劑的大約有效抑菌濃度，并不能給出防腐劑對(duì)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)作用的情況，我們最關(guān)心的是如何使用最少的防腐劑濃度來抑制致病微生物的生長(zhǎng)。所以有必要測(cè)定防腐劑對(duì)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響，而且有重要的應(yīng)用意義。將經(jīng)過培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)菌液梯度稀釋，通常選取2～3個(gè)稀釋度為宜，分別做10倍遞增稀釋的同時(shí)，吸取該稀釋液的定量刻度吸管1ml稀釋液滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，及時(shí)將冷卻到46℃的培養(yǎng)基注入平皿，混合均勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，計(jì)算平皿中菌落的數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得到每個(gè)樣品的含細(xì)菌數(shù)量，抑菌效率的高低以細(xì)菌減少的百分率高低來衡量。抑菌率(%)=1-(A-B)/A×100式中，A為被試樣品起始平均菌落數(shù)；B為被試樣品培養(yǎng)后平均菌落數(shù)。由干重法來測(cè)定黑曲霉的生長(zhǎng)抑制曲線，可用下式計(jì)算防腐劑的抑菌率。抑菌率I(%)=100-W1/W2×100式中，W1為添加防腐劑培養(yǎng)液中菌絲重；W2為不加防腐劑培養(yǎng)液中菌絲重。1.3.7最理論抑菌率與衰減系數(shù)法計(jì)算由于微生物適應(yīng)性強(qiáng)，易于產(chǎn)生抗藥性，所以一般情況下防腐劑的抑菌效果均為時(shí)間的衰減函數(shù)：I=Ae-μt式中，I為t時(shí)刻的抑菌率；A為防腐劑在供試濃度下對(duì)目標(biāo)菌種的最高理論抑菌率；M為衰減系數(shù)。從衰減方程可求得防腐劑抗菌作用的最高理論抑菌率A，衰減系數(shù)μ和半衰期t0.5值。生長(zhǎng)適應(yīng)期(t適應(yīng))為細(xì)菌和酵母從接種到A600nm或A600nm值增加5%所需要的培養(yǎng)時(shí)間。1.3.8ph值對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯抑菌效果的影響將培養(yǎng)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂的pH值分別調(diào)為4.5、5.5、6.5、7.5，培養(yǎng)真菌的麥芽汁瓊脂pH值分別調(diào)為4.5、5.5、6.5、7.5。用平板稀釋法測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯在不同pH值時(shí)的抑菌效果。其中，測(cè)定大腸桿菌時(shí)防腐劑濃度為0.025%，測(cè)定其余菌種時(shí)防腐劑濃度為0.01%。1.3.9羥基苯甲酸殼聚糖酯抑菌活性測(cè)定將對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯配成1.00%的溶液，予以121℃、20min,100℃、20min,25℃、20min處理，用平板稀釋法測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯經(jīng)不同溫度處理后的抑菌率。其中，測(cè)定大腸桿菌時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的濃度為0.025%，測(cè)定其余菌種時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯濃度為0.01%。1.3.10.食品體系中對(duì)氨基苯甲酸殼聚糖酯的抗菌活性1.3.1酸殼聚糖酯至最終濃度的確定巴氏殺菌蘋果汁(pH3.7)進(jìn)行熱殺菌，加入對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯至最終濃度為0.005%、0.01%、0.02%和0.03%。懸浮液接種106CFU/ml大腸桿菌，于25℃培養(yǎng)。于0、2、4和8h取樣，于普通瓊脂培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)。1.3.1總菌數(shù)的測(cè)定未殺菌的肉汁(1ml)中加入0.01%對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯于25℃分別經(jīng)過6、12h培養(yǎng)，取樣，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上對(duì)需氧菌和厭氧菌總菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。2結(jié)果與分析2.1抑菌譜的比較從表1可以看出，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)實(shí)驗(yàn)中用到的各種細(xì)菌、酵母和霉菌的抑制能力都很好，在所試驗(yàn)的pH下，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.025%，對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度均為0.01%，均顯著優(yōu)于殼聚糖，略大于尼泊金丁酯；對(duì)啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的MIC值均為0.05%，顯著小于殼聚糖，比尼泊金戊酯略低；對(duì)黑曲霉和桔青霉的MIC值為0.01%，遠(yuǎn)低于殼聚糖。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論表明對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌譜寬于殼聚糖，與尼泊金戊酯接近。對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌能力也遠(yuǎn)大于其反應(yīng)物殼聚糖和對(duì)羥基苯甲酸。2.2防腐保鮮對(duì)生物生理生化狀態(tài)的影響當(dāng)細(xì)菌接種到新的培養(yǎng)基中后，最初并不立即開始繁殖，表現(xiàn)出培養(yǎng)基吸光值的增加或霉菌孢子的萌發(fā)。此階段主要是調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝酶系以適應(yīng)新的環(huán)境，變化主要發(fā)生在微生物個(gè)體內(nèi)，主要是微生物生理生化狀態(tài)的變化，而不是量的變化，不能從宏觀上表現(xiàn)出來。所以我們看到在微生物生長(zhǎng)曲線上有一段時(shí)間吸光度一直維持在最初的水平，這段時(shí)間常被稱為生長(zhǎng)適應(yīng)期。當(dāng)培養(yǎng)基中加入防腐劑后，防腐劑會(huì)干擾微生物的體內(nèi)代謝活動(dòng)，如果防腐劑濃度低時(shí)，會(huì)增加微生物自我調(diào)節(jié)時(shí)間，直到防腐劑被體內(nèi)酶系代謝或微生物自身的酶系發(fā)生改變產(chǎn)生了一定抗藥性才會(huì)生長(zhǎng)，宏觀上表現(xiàn)出延長(zhǎng)了微生物的生長(zhǎng)適應(yīng)期。如果防腐劑濃度足夠高時(shí)，可能會(huì)徹底破壞微生物生命活動(dòng)，則有可能對(duì)微生物起到殺滅作用。所以，從生長(zhǎng)曲線的變化可以看出防腐劑對(duì)微生物的抑菌能力的大小、強(qiáng)弱。2.2.1對(duì)革蘭氏陽性菌大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響圖1為對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響。由圖1可以看出，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的存在可顯著地延長(zhǎng)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)適應(yīng)期。不添加防腐劑時(shí)，培養(yǎng)4h后金黃色葡萄球菌便開始繁殖，吸光度增大，當(dāng)加防腐劑0.005%時(shí)，生長(zhǎng)適應(yīng)期為8h；濃度為0.008%時(shí)，適應(yīng)期延長(zhǎng)到14h，濃度為0.011%時(shí)，適應(yīng)期延長(zhǎng)到36h是空白的9倍。圖2為對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)防腐劑的存在也可有效地延長(zhǎng)了革蘭氏陽性菌大腸桿菌的生長(zhǎng)適應(yīng)期。不添加防腐劑時(shí)，培養(yǎng)5h后大腸桿菌便開始繁殖，吸光度增大，當(dāng)加防腐劑0.01%時(shí)，生長(zhǎng)適應(yīng)期為8h；濃度為0.02%時(shí)，適應(yīng)期延長(zhǎng)到12h，濃度為0.03%時(shí)，適應(yīng)期延長(zhǎng)到20h，是空白的4倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用。2.2.2抑制螺母的效果圖3為對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)曲線的影響。由圖3可以看出對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)酵母有很強(qiáng)的抑制能力。2.2.3培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線圖4是對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)曲線的抑制作用。由圖4可以看出，液體培養(yǎng)的結(jié)果表明添加對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的三角瓶中菌絲體的出現(xiàn)和生長(zhǎng)受到了抑制。培養(yǎng)約20h即可見到空白樣品中有細(xì)小的菌絲球，36h測(cè)得其干重為6.4mg，添加0.05%對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的培養(yǎng)基中只有2.1mg的菌絲，比空白少67%，空白樣品中菌絲球生長(zhǎng)很快，72h即達(dá)到22.3mg，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已消耗殆盡，故在生長(zhǎng)曲線上體現(xiàn)出菌絲體的生長(zhǎng)速度開始變慢。添加了防腐劑的樣品一方面菌絲體的出現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)，另一方面菌絲體的生長(zhǎng)速度也明顯低于空白樣品。2.3微生物的抗菌率表2為對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑菌率。2.4不同微生物的抑菌效果根據(jù)圖1～4以及表2可以分別計(jì)算得到0.008%對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)金黃色葡萄球菌、0.02%防腐劑對(duì)大腸桿菌、0.007%防腐劑對(duì)啤酒酵母以及0.008%防腐劑對(duì)黑曲霉的A、μ及t0.5。結(jié)果見表3。由表3可直觀地看出對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)不同微生物的抑菌效果。就抑菌強(qiáng)度而言，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯優(yōu)于殼聚糖。對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的衰減系數(shù)較小，半衰期較長(zhǎng)，說明對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抗代謝能力高于其反應(yīng)物殼聚糖。這可能是因?yàn)閷?duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的分子量大，在相同的動(dòng)能下，其分子運(yùn)動(dòng)速度最小，與微生物分解酶系作用的幾率也顯著地小于反應(yīng)物殼聚糖。2.5ph值對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯抑菌效果的影響pH值是溶液的重要性質(zhì)，對(duì)于對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的溶解性以及抗菌活性而言，pH值也是至關(guān)重要的因素。由于強(qiáng)酸性對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)本身具有一定的抑制作用，為了排除這一影響，選定的pH范圍在4.5～7.5。測(cè)定結(jié)果見表4、5。從表4、5可以觀察到，在試驗(yàn)的pH值范圍內(nèi)，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和黑曲霉均能完全或很好的抑制作用。但對(duì)大腸桿菌而言，pH4.5、5.5和6.5時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯能完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)；當(dāng)pH值為7.5時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯對(duì)大腸桿菌的抑制作用則較弱。可以看出對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌效果受介質(zhì)pH一定的影響，這是由于在酸性環(huán)境下，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯中的游離氨基發(fā)生質(zhì)子化，更易與帶負(fù)電荷的微生物相互作用，從而與對(duì)羥基苯甲酸酯共同發(fā)揮抑菌作用，而在pH大于6.5以上時(shí)，氨基不再呈現(xiàn)抑菌作用，所以在較低pH值條件下對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯的抑菌作用要大于pH值較高的環(huán)境。這也與尼泊金酯受pH值影響不大的情況略有差別。2.6熱處理對(duì)納米思考的抗菌性能影響加熱是食品保藏的重要方法，它的突出特點(diǎn)是其作用機(jī)制是使微生物失活，而不只是抑制微生物生長(zhǎng)。防腐劑作用的發(fā)揮與溫度有協(xié)同作用，在防腐劑存在下殺死微生物所要求的溫度比沒有防腐劑存在時(shí)低得多，即在低于微生物失活的加熱溫度下，可增加微生物對(duì)于一些防腐劑的敏感性，這在實(shí)際應(yīng)用中具有非常重要的意義，結(jié)果見表6。由表6可見：對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯經(jīng)100℃(20min)和121℃(20min)高溫處理后，對(duì)大腸桿菌的抑制作用有所減弱，對(duì)其它菌種則有良好的抑制作用。由此可見，對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯具有良好的熱穩(wěn)定性，說明它可在食品加工中承受熱處理，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過熱處理后，尼泊金酯的抗菌性能下降25%，可能是由于其升華揮發(fā)性質(zhì)，使防腐劑在培養(yǎng)基中的實(shí)際濃度下降。這是因?yàn)閷?duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯分子量較大，穩(wěn)定性要優(yōu)于小分子量的尼泊金酯。2.7用氨基丙烯酸和聚糖酯來吃2.7.1羥基苯甲酸殼聚糖酯細(xì)菌下降值在蘋果汁(pH3.7)中大腸桿菌的存活數(shù)在防腐劑不存在時(shí)于25℃下培養(yǎng)8h僅下降1個(gè)對(duì)數(shù)值。加入0.01%、0.02%或0.03%對(duì)羥基苯甲酸殼聚糖酯均可增加細(xì)菌的下降值，并呈現(xiàn)以一種濃度依賴性關(guān)系(圖5)。試驗(yàn)的最高防腐劑濃度(0.03%)可導(dǎo)致大腸桿菌一穩(wěn)定的下降值，經(jīng)過與防腐劑接觸12h后細(xì)菌數(shù)下降3個(gè)對(duì)數(shù)值，對(duì)于用0.01%或0.02%防腐劑接觸過的細(xì)菌后可觀察到細(xì)