糖尿病與蛋白質硝基化

氨基酸硝化是指含有蛋白質分子的酪氨酸殘基的硝基含有3-硝基磺酸。3-硝基酪氨酸的形成影響蛋白質的結構和功能。近年來,2型糖尿病的發(fā)病率在發(fā)達國家以及發(fā)展中國家都呈上升趨勢。糖尿病及其并發(fā)癥已成為除腫瘤和心腦血管病之外,對國人健康構成嚴重威脅的疾病。目前的研究表明,蛋白質硝基化與糖尿病及其各種并發(fā)癥有密切關系,了解蛋白質硝基化在糖尿病進程中的作用,有助于找到治療糖尿病及其并發(fā)癥的途徑。1關于蛋白質硝基化的機制酪氨酸硝基化作為一種蛋白質翻譯后的修飾,常常在氧化應激下伴隨活性氧和活性氮的增加而產生。1.1抗氧化防御系統(tǒng)氧對于高能量需求的復雜有機體來說是必不可少的,但同時也是一種有毒物質,因為它形成一些不完全的中間還原產物:O-·2、H2O2、OH·,這些產物統(tǒng)稱為活性氧(ROS)。人體細胞有許多酶和非酶系統(tǒng)來阻止或限制ROS的破壞作用,這一防御系統(tǒng)包括:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及小分子的維生素C、E、β-胡蘿卜素。氧化應激條件下,由于活性氧的過度生成使細胞的抗氧化防御系統(tǒng)不能完全消除有毒自由基或失去其防御功能,導致內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡。NO是一種氣體自由基,近年來大量資料表明炎癥條件下誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的過量表達會使NO水平升高,產生細胞毒性,造成病理損傷。體內發(fā)生氧化應激時產生大量的NO和ROS,NO被氧化成ONOOˉ,ONOOˉ作為強氧化劑和硝基化劑與蛋白質、脂質、核酸等大分子反應。1.23硝化胰島素檢測Turko等提出3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)的生成途徑包括ONOOˉ依賴途徑和過氧化物酶、過氧化氫酶依賴途徑等非ONOOˉ依賴途徑。各途徑均使蛋白質酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應,形成最終產物3-NT。蛋白質硝基化后能誘導酶活性的喪失、細胞的死亡和凋亡。池泉等研究發(fā)現,分離出的單硝基化胰島素其受體結合能力為正常胰島素的69%,降血糖活性有一定程度的降低。硝化胰島素的二級結構也發(fā)生了變化,α螺旋的含量明顯降低。但是,對蛋白質硝基化的研究,體外實驗和體內情況不一致,需要進一步證實在體內是硝化而不是它氧化性修飾改變了蛋白質的功能,以及硝化到什么程度才能顯著改變蛋白質的功能。2流行趨勢分析隨著社會的工業(yè)化進程加快和人民生活水平不斷提高,糖尿病呈流行趨勢,且呈上升勢態(tài)。目前據估計,全球約有1.5億2型糖尿病患者。預計到2025年,全球2型糖尿病患者將增至3億。在亞洲,以印度和中國糖尿病患者人數增幅和絕對數最大。2.1糖尿病患者的糖代謝和血糖國外已有研究表明,糖尿病患者組織中蛋白質硝基化程度增高。Turko等于2001年在糖尿病小鼠心肌中發(fā)現線粒體蛋白的琥珀酰輔酶A:3-酮酸輔酶A轉移酶(SCOT)發(fā)生了酪氨酸的硝基化。這是首次對糖尿病患者體內的NT進行特定蛋白的定位,為后續(xù)研究NT與糖尿病及其并發(fā)癥的關系提供了指導。Antonio等發(fā)現糖尿病患者的內皮細胞和糖尿病小鼠的視網膜細胞在血糖正常一周后其高血糖應激的標志物3-NT仍保持誘導表達。糖尿病患者的心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞凋亡與細胞外NT水平相關,凋亡的心肌細胞中存在NT富集現象。Ishii等在糖尿病小鼠中發(fā)現,糖尿病早期腎皮質中O-·2和NO生成增加,并且用蛋白質免疫印跡技術證實了腎皮質中3-NT的增加。這些結果無疑對探索糖尿病的發(fā)病機制有著積極的意義,但并不是所有的研究都支持上述結論。例如,Ahmed等研究發(fā)現,1型糖尿病患者血紅蛋白中的3-NT殘基含量降低。Wang等采用HPLC法測得墨西哥裔美國人糖尿病患者血漿NT水平與正常對照相比無顯著性差異。這些實驗結果的不同可能由各檢測方法和檢測水平不同所致。2.2氧化應激作用Antonio等證明在2型糖尿病人群中,血漿NT水平與血糖濃度呈正相關,餐后高血糖現象也與酪氨酸硝基化現象伴隨出現。有研究表明,用高濃度血糖灌注離體心臟,將明顯地升高冠狀動脈灌注壓并伴隨著3-NT的生成。這證明了氧化應激介導了高血糖引起的血管損傷,以及3-NT為糖尿病患者氧化損傷的標志物。Ccsentino等發(fā)現長時間暴露于高血糖的人主動脈內皮細胞,NO合酶基因表達增加,相應蛋白質和NO的釋放也增加,且與活性氧產物的增加相關聯(lián),O-·2產物在高血糖時比正常時增加了3倍。Antonio等用普蘭林肽治療2型糖尿病患者,在降低餐后血糖的同時也明顯降低了3-NT的含量,減少了餐后高血糖的氧化應激。但也有研究認為3-NT水平與餐后血糖濃度的正相關關系只有在減少攝入某些抗氧化維生素后才明顯。2.3動脈血流動力學及免疫藥物的作用糖尿病對身體的危害主要來自高血糖導致的多種并發(fā)癥,而心血管系統(tǒng)是糖尿病并發(fā)癥的主要受累系統(tǒng)之一。糖尿病患者的動脈粥樣硬化發(fā)病率比非糖尿病患者高2~4倍,而且發(fā)病年齡提前,病情也較重。在動物實驗中,糖尿病高血壓小鼠主動脈中3-NT蛋白的表達明顯高于正常血壓糖尿病小鼠。Turko等對糖尿病小鼠心肌細胞線粒體功能的研究發(fā)現,蛋白質的硝基化影響蛋白質的功能,而抗硝基化的防御系統(tǒng)可以保護特異性功能蛋白。Turko等在線粒體中找到發(fā)生硝基化的蛋白質后,進一步采用四氧嘧啶敏感和四氧嘧啶抗性的小鼠進行研究,發(fā)現糖尿病小鼠心肌線粒體SCOT的硝基化是一個普遍現象,其結果可能導致線粒體功能障礙。在2型糖尿病患者的血液中,硝基化載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,ApoA-I)含量明顯增高,比正常同齡對照高50%,而ApoA-I的氧化損傷與動脈粥樣硬化關系密切。一系列的研究表明:人動脈粥樣硬化組織中含有酪氨酸硝基化的蛋白質,且這種硝基酪氨酸與一氧化氮合酶(NOS)表達密切相關,動脈粥樣硬化各階段富含巨噬細胞的受損部位都能檢測到NOS和硝基化蛋白質。另有研究認為自身免疫性心肌炎總是伴隨著NOS的表達和酪氨酸硝基化蛋白質在巨噬細胞以及心肌內皮細胞中的累積;原發(fā)性擴張性心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)患者心臟中NT水平是同齡對照正常人的2倍,免疫沉淀證實硝基化主要發(fā)生在肌漿網Ca2+-ATP酶2a(SERCA2a),而SERCA2a硝基化可導致Ca2+-ATP酶的失活,從而引起心力衰竭。蛋白質硝基化普遍存在于心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展階段,但其在心血管疾病中的具體作用方式和作用機制至今尚不完全明了。例如高血壓與內皮細胞功能障礙、O-·2增加和NO產生降低有關,但是有關高血壓和NOS表達以及內皮細胞損傷之間的分子機制,至今還沒有完整的解釋。2.4苯基化酪氨酸檢測在美國,糖尿病是引起終末期腎病的主要原因,并占其總數的1/3。Ishii等利用單克隆抗硝基化酪氨酸的抗體免疫印記技術,發(fā)現糖尿病小鼠腎皮質中70kD蛋白質的硝基化酪氨酸含量是正常對照組的3倍。這表明氧化應激在糖尿病病程早期加速了腎皮質過氧化陰離子的產生,也增加了NO的終產物。2.53氧化應激引起糖尿病患者視網膜免疫組化糖尿病是引起30~65歲人群失明的主要原因,糖尿病患者失明的發(fā)生率是非糖尿病人群的20倍以上,視網膜病變在15歲以上的糖尿病患者中最為常見。糖尿病視網膜病涉及炎性過程,其中的NO、NOS是重要的炎性介質,ROS的慢性過量生成會導致糖尿病患者視網膜細胞線粒體功能紊亂,并且其產物如3-NT在糖尿病性視網膜中也增加。在動物實驗中已經證實,氧化應激及其產物3-NT不僅在糖尿病視網膜病的進展過程中起負作用,而且在控制血糖之后,也抵抗視網膜病的逆轉,導致了代謝記憶現象。但是3-NT在視網膜上的作用靶點以及硝基化在糖尿病視網膜病中的作用機制尚不清楚。抗氧化治療在動物實驗中對視網膜病的進展有阻礙作用,但在臨床實驗中抗氧化治療對視網膜病的效果還很模糊。2.63對糖脂質過氧化的調整糖尿病神經病變臨床表現多樣化,其致病因素也是多樣的。高血糖為一突出的因素,許多證據證明氧化應激參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生,如末梢對稱性多發(fā)性神經病(distalsymmetricpolyneuropathy)。在糖尿病動物模型實驗中,動物的脊髓及其背側根部的神經元對高血糖介導的氧化應激更敏感,更易發(fā)生細胞凋亡。Cameron等在2001年指出:高血糖導致內皮細胞損傷和引起氧化應激,進而使NO生成增加,而NO使血管舒張,導致神經局部缺血,引起軸突損傷甚至神經細胞死亡。3降血糖治療糖尿病并發(fā)癥的作用機制抗蛋白質硝基化治療的途徑包括減少活性氮(RNS)和活性氧的生成。根據以往的研究成果,抗氧化劑特別是食物中天然的具有抗氧化作用的營養(yǎng)素如維生素E、維生素C、微量元素硒等是活性氮的有效清除劑,即也是有效的抗硝基化劑。此外,分解ONOO-的催化劑、抗氧化酶催化劑等也能減少活性物質的生成。不少研究證實食物中存在的非營養(yǎng)素成份——生物類黃酮也具有較強的抗氧化、抗硝化作用。然而,目前還沒有實驗證實食入抗氧化食物是直接降低體內硝基化水平而不是通過影響氧化應激水平,進而改變疾病的進展。在動物實驗中,他汀類的藥物——西立伐他汀可以改善心肌梗塞后小鼠的左室重構,并且可以降低蛋白質硝基化水平。Szabo等研究發(fā)現FP15,一種有力的過氧亞硝酸鹽分解催化劑,可以防止糖尿病小鼠發(fā)生血管和心肌的功能紊亂,并且可以減少糖尿病胰腺胰島細胞中的3-NT量。Antonio等發(fā)現1型血管緊張素Ⅱ(AT-1)受體拮抗劑依貝沙坦可以降低糖尿病患者血漿NT水平,并且能在急性高血糖狀態(tài)下有效地對抗3-NT的形成。Antonio等對36名1型糖尿病患者和12名正常對照進行降血糖和維生素C、替米沙坦治療后發(fā)現,單純用胰島素降低高血糖或用維生素C治療都不能改善內皮細胞功能紊亂或氧化應激狀態(tài),必須二者聯(lián)合應用;同時發(fā)現替米沙坦也同維生素C一樣,是一種抗氧化劑。然而,用抗氧化物質灌注系統(tǒng)或使抗氧化物酶過度表達可能和過度暴露于RNS/ROS中一樣危險。因此,主要的問題是鑒別出RNS/ROS有利和有害作用之間的濃度界限。另一個問題是,改變硝基化酪氨酸能否有利于疾病的進展,這需要鑒定出發(fā)生硝基化的特定蛋白質,并且證明這種蛋白質的功能改變與并發(fā)癥的進展相關。也有學者認為抗氧化劑治療心血管疾病的作用有限,因為它不能有效地清除已經存在的氧化損傷產物。比如:維生素E在細胞膜水平可以阻止活性自由基的增加,但是