第六講原核基因表達調控

緒論一、乳糖操縱子的調控模式二、色氨酸操縱子的調控模式三、其他操縱子的調控機制四、原核生物種的轉錄后調控緒論原核生物和單細胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環境中，食物供應毫無保障，只有能根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質，使代謝過程適應環境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個每30min增殖一倍的109細菌群體中，若有一個細菌變成了29.5min增殖一倍，大約經過80天的連續生長后，這個群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長速度。

一個大腸桿菌細胞中約有2500-3000個基因。估計正常情況下，可帶有107個蛋白質，平均每個基因產生3000多個蛋白質分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個核糖體，有50余種核糖體結合蛋白，數量也很驚人。此外，負責糖酵解系統的蛋白質數量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導酶，其含量可少至每細胞僅1-5個分子。一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種“開-關”（on-off）活性是通過調節轉錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調節的。當我們說一個系統處于“off”狀態時，也有本底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞只合成1或2個mRNA分子。所謂“關”實際的意思是基因表達量特別低，很難甚至無法檢測。科學家把這個從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達(geneexpression)，對這個過程的調節就稱為基因表達調控(generegulation或genecontrol)。要了解動、植物生長發育的規律、形態結構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念，掌握了基因表達調控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學奧妙的金鑰匙。

基因表達調控主要表現在以下幾個方面：

①轉錄水平上的調控(transcriptionalregulation)；

②mRNA加工成熟水平上的調控(differentialprocessingofRNAtranscript)；

③翻譯水平上的調控(differentialtranslationofmRNA).原核生物中，營養狀況(nutritionalstatus)和環境因素(environmentalfactor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormonelevel)和發育階段(developmentalstage)是基因表達調控的最主要手段，營養和環境因素的影響力大為下降。一、乳糖操縱子的調控模式

大腸桿菌乳糖操縱子(lactoseoperon)包括3個結構基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(promoter,P)結合，通過操縱區(operator,O)向右轉錄。轉錄從O區的中間開始，按Z→Y→A方向進行，每次轉錄出來的一條mRNA上都帶有這3個基因。轉錄的調控是啟動區和操縱區進行的.Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。β-半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙酰基轉到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

1．酶的誘導-lac體系受調控的證據在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養基中，lac+基因型每個大腸桿功細胞內大約只有1-2個酶分子。如果在培養基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。科學家把大腸桿菌細胞放在加有放射性35S標記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導物的培養基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細菌轉移到不含35S、無放射性的培養基中，隨著培養基中誘導物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發現這種酶無35S標記。說明酶的合成不是由前體轉化而來的，而是加入誘導物后新合成的。

已經分離在有誘導物或沒有誘導物的情況下都能產生lacmRNA的突變體，這種失去調節能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：I型和O型。I型：野生型為I+，突變型為I-

O型：野生型為O+，突變型為Oc。I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結構基因均表現為永久表達，所以I基因被稱為調節基因(regulatorygene)。研究發現，I基因是一個產生阻遏物的調節基因，其產物使體系關閉。I-突變體由于不能產生阻遏物，使細胞成為lac永久表達型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細胞中的lac仍然被抑制。遺傳學圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個位點或一個非編碼區域，而不是一個基因，因為可編碼的基因具有互補性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產物是誘導型合成還是永久型合成，O區域稱為操縱基因。2.操縱子模型

Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，可以用實驗方法進行研究，因此選為突破口，終于通過大量實驗及分析，建立了該操縱子的控制模型。①Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。②這個mRNA分子的啟動子緊接著O區，而位于I與O之間的啟動子區（P），不能單獨起動合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。③操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。④當阻遏物與操縱基因結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。⑤誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱基因結合，從而激發lacmRNA的合成。當有誘導物存在時，操縱基因區沒有被阻遏物占據，所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成。3.Lac操縱子的本底水平表達

因為誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而運轉誘導物需要透過酶。在非誘導狀態下有少量（1-5個mRNA分子）lacmRNA合成--本底水平永久型合成。4.葡萄糖對lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應

研究表明，葡萄糖對lac操縱子表達的抑制作用是間接的，因為存在一種大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導合成lacmRNA。

5.cAMP與代謝物激活蛋白

當葡萄糖和乳糖同時存在于培養基中時，lac啟動子表達受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細胞內cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導，一度停止生長的細胞又恢復分裂。如果將細菌放在缺乏碳源的培養基中，細胞內cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養基中培養，細菌中的cAMP濃度就會很低；如果將細菌置于甘油或乳糖等不進行糖酵解的碳源培養基中，細菌中cAMP的濃度也會很高。

研究證實，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Cataboliterepression)現象的實質是該代謝物降低了細胞中cAMP的含量.事實上，cAMP-CAP復合物是lac體系的positiveregulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negativeregulator)。cAMP-CAP不但能與DNA相結合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉錄起始復合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominantnegative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個"環"的亞基存在，lacI+基因產物（阻遏物）無法與O區相結合lacoperon得到表達。6.lac操縱子DNA的調控區域--P.O.區

lacP（啟動子區）從I基因結束到mRNA轉錄起始位點止，共長82bp（-82～+1）O區就是阻遏物結合區，位于P區后半部分和轉錄起始區（-7～+28），該區序列有對稱性，其對稱中心點在+11位。P區的CAMP-CAP結合區（-67～-52）也有對稱性，其對稱位點在-60～-59之間。

在一個完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉移酶的拷貝數比例為1:0.5:0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節所致。①lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。這種現象發生的頻率取決于每一個后續的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。

②在lacmRNA分子內部，A基因比Z基因更易受內切酶作用發生降解，因此，在任何時候Z基因的完整拷貝數要比A基因多。二、色氨酸操縱子的調控模式色氨酸操縱子(tryptophaneoperon)負責色氨酸的生物合成，當培養基中有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開，trp基因表達，色氨酸或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程（而不是誘導過程）中起作用。由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調控。

色氨酸的合成分5步完成。每個環節需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉錄在一條多順反子mRNA上，分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶、鄰氨基苯甲酸異構酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。trpE基因是第一個被翻譯的基因，和trpL和trpa（不是trpA）。trp操縱子中產生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠，后者在大腸桿菌染色體圖上25min處，而前者則位于90min處。在位于65min處還有一個trpS（色氨酸tRNA合成酶），它和攜帶有trp的tRNATrp也參與trp操縱子的調控作用。

L區編碼了前導肽，當有高濃度Trp存在時，由于弱化子a的作用，轉錄迅速減弱停止，生成140核苷酸的前導RNA；當Trp濃度較低時，弱化子不起作用，轉錄得以正常進行，生成長約7kb的mRNA，操縱子中第一個結構基因的起始密碼子AUG在+162處。1．trp操縱子的阻遏系統

trpR基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產物因此被稱為輔阻遏蛋白(aporepressor)。除非培養基中有色氨酸，否則這個輔阻遏蛋白不會與操縱區結合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結合形成有活性的阻遏物，與操縱區結合并使之關閉轉錄trpmRNA。

阻遏-操縱機制對色氨酸來說是一個一級開關，主管轉錄是否啟動，相當于粗調開關。trp操縱子中對應于色氨酸生物合成的還有另一個系統進行細調控，指示已經啟動的轉錄是否繼續下去。這個細微調控是通過轉錄達到第一個結構基因之前的過早終止來實現的，由色氨酸的濃度來調節這種過早終止的頻率。2．弱化子與前導肽

在trpmRNA5'端trpE基因的起始密碼前有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導區，研究發現，當mRNA合成起始以后，除非培養基中完全沒有色氨酸，轉錄總是在這個區域終止，產生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉錄。因為轉錄終止發生在這一區域，并且這種終止是被調節的，這個區域就被稱為弱化子。

分析前導肽序列，發現它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，編碼了一個14個氨基酸的多肽。該多肽有一個特征，其第10位和11位有相鄰的兩個色氨酸密碼子。正是這兩個相連的色氨酸密碼子（組氨酸、苯丙氨酸操縱子中都有這種現象）調控了蛋白質的合成。當培養基中色氨酸的濃度很低時，負載有色氨酸的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當4區被轉錄完成時，核糖體才進行到1區（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），這時的前導區結構是2-3配對，不形成3-4配對的終止結構，所以轉錄可繼續進行，直到將trp操縱子中的結構基因全部轉錄。

當培養基中色氨酸濃度較高時，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區被轉錄之前就到達2區，使2-3區不能配對，3-4區自由配對形成基一環終止子結構，轉錄被終止，trp操縱子被關閉。3．trp操縱子弱化機制的實驗依據

trpS5是溫度敏感型突變株，它所編碼的Trp-tRNAtrp合成酶只在30℃時有活性，42℃時無酶活性。比較野生型和突變型在42℃和30℃時，突變體的Trp操縱子與野生型一樣受色氨酸濃度的調控。42℃時，突變體中Trp操縱子的表達不受色氨酸濃度的調控。

另有一個缺失前導區及D基因的突變體（trpΔLD102），該細菌在有色氨酸的培養基中仍有很高的色氨酸合成酶活性。

TrpΔED53中L不缺失（弱化子存在），trpΔLD102中L缺失（弱化子不存在），缺失前導區后的表達比有前導區的表達要高得多，充分說明trp操縱子的表達調控除阻遏作用外，還受到前導區的影響，失去了這個因素就失去了一個調控機制。4．阻遏與弱化作用的協調

有實驗證明，在不加色氨酸的培養基中，trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，現在一般認為，野生型細胞中同時存在著有活性和無活性的阻遏物，培養基中色氨酸濃度的變化，能夠使這兩種阻遏物間的平衡發生傾斜，最終做出關閉或啟動trp操縱子的決定，從而維持一定的色氨酸含量。細菌中為什么要有弱化子系統呢？

一種可能是阻遏物從有活性向無活性的轉變速度極低，需要有一個能更快地做出瓜的系統，以保持培養基中適當的色氨酸水平。或者，弱化子系統主要是對外源色氨酸濃度做出反應。外源色氨酸濃度很低的信號雖然足以引起trp操縱子的去阻遏作用，但是這個信號還不足以很快引發內源色氨酸的合成。在這種環境下，弱化子就通過抗終止的方法來增加trp基因表達，從而提高內源色氨酸濃度。

那么為什么還要有阻遏體系呢？目前認為阻遏物的作用是當有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導mRNA的合成，它使這個合成系統更加經濟三、其他操縱子的調控機制

1．半乳糖操縱子大腸桿菌半乳糖操縱子(galactoseoperon)包括3個結構基因：

異構酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，

半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galactosetransferase,galT)，

半乳糖激酶(galactosekinase,galk)。

這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。GalR與galE、T、K及操縱區O等離得很遠，而galR產物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。

gal操縱子的特點：

①它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉錄；

②它有兩個O區，一個在P區上游-67--53，另一個在結構基因galE內部。

因為半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人們猜想葡萄糖存在時半乳糖操縱子不被誘導，但實際上有葡萄糖存在時，gal操縱子仍可被誘導。現已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結構基因高效表達）；而另一類突變株中gal基因的表達完全依賴于葡萄糖，培養基中如無葡萄糖存在，這些細菌的gal基因不表達，不合成半乳糖代謝酶類。分析gal操縱子P-O區的DNA序列發現，該操縱子確實存在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結合位點S1和S2。

從S1起始的轉錄只有在培養基中無葡萄糖時，才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉錄。當有cAMP-CAP時，轉錄從S1開始，當無cAMP-CAP時，轉錄從S2開始。為什么gal操縱子需要兩個轉錄起始位點？

半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關的物質--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產物。生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構酶。現在設想只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當培養基中有葡萄糖存在時就有能合成異構酶。假如唯一的啟動子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導狀態，這無疑是一種浪費。無論從必要性或經濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（S1）對高水平合成進行調節。2．阿拉伯糖操縱子

阿拉伯糖(arabinose)是另一個可以為代謝提供碳源的五碳糖。在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD，分別編碼3個酶：araB基因編碼核酮糖激酶(ribulokinase)，araA編碼L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinoseisomerase)，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶(L-ribulose-5p