常用核酸提取技術(shù)介紹常用核酸提取技術(shù)介紹

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言常用核酸提取技術(shù)介紹核酸的存在形式核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在；真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子；原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNA有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子；病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。常用核酸提取技術(shù)介紹常用核酸提取技術(shù)介紹利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異提取DNA、RNA，去除其他成分。核酸提取的基本思路常用核酸提取技術(shù)介紹

提取純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸提取的原則常用核酸提取技術(shù)介紹核酸提取應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。常用核酸提取技術(shù)介紹核酸提取應(yīng)注意的問題：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。常用核酸提取技術(shù)介紹破碎提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中常用核酸提取技術(shù)介紹細(xì)胞裂解方式分類：

物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法、勻漿法化學(xué)方式：表面活性劑（SDS法）、堿裂解法生物方式：酶法（溶菌酶、蛋白酶K等）常用核酸提取技術(shù)介紹濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNA和DNA在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物常見樣本提取方法總結(jié)：常用核酸提取技術(shù)介紹吸附材料結(jié)合法：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。常用核酸提取技術(shù)介紹1、濃縮煮沸裂解法：（以HBV為例）50ul濃縮液+50ul血清12000rpm10min棄上清加入20-50ulDNA裂解液吹打混勻100℃10min

12000rpm5min取上清加樣濃縮液主要成分：聚乙二醇（PEG）、NaCl裂解液主要成分：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS常見核酸提取方法簡介常用核酸提取技術(shù)介紹聚乙二醇（PEG）HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n＞4PEG為有機(jī)聚合物，無毒，親水性強(qiáng)，相對分子量為6K-20K；PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液pH值和溫度等因素的影響，采用該方法可將病毒量濃縮10倍以上。常用核酸提取技術(shù)介紹裂解液裂解原理：Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～100℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；常用核酸提取技術(shù)介紹特點(diǎn)：操作相對簡單，成本低，但抗干擾能力差，不利于自動(dòng)化操作。常用核酸提取技術(shù)介紹原理：標(biāo)本經(jīng)裂解消化后，釋放出核酸，核酸與磁珠結(jié)合(特異性的和非特異性的)利用磁珠分離儀器將核酸提取純化，作為PCR反應(yīng)的模板。磁珠其內(nèi)核為氧化鐵，直徑0.5-50um不等，一般廣泛應(yīng)用于DNA、RNA純化的磁珠為硅質(zhì)膜磁珠。磁珠在高鹽條件下與核酸結(jié)合，而在低鹽環(huán)境下被洗脫，可用于全血、組織、細(xì)菌、病毒、植物的核酸純化。2、磁珠吸附法：（以HBV為例）常用核酸提取技術(shù)介紹第一步：細(xì)胞的裂解：破碎細(xì)胞，并向溶液中加入磁珠。第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合。主要步驟：常用核酸提取技術(shù)介紹第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）。第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。常用核酸提取技術(shù)介紹特點(diǎn)：特異性好，抗干擾能力強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)和全自動(dòng)操作。常用核酸提取技術(shù)介紹原理：采用硅膠膜吸附核酸，而對其他生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類既不相親也不吸附，因而可得到純化的核酸。3、硅膠柱吸附法：（以腫瘤標(biāo)本為例）常用核酸提取技術(shù)介紹樣品化學(xué)裂解洗脫洗滌主要步驟：常用核酸提取技術(shù)介紹注意事項(xiàng)：二甲苯有毒且對后續(xù)試驗(yàn)有影響，一定要用乙醇洗干凈。乙醇揮發(fā)時(shí)間一定不要打折扣。加熱時(shí)要將樣品封好口，以免過熱時(shí)管子蓋崩開進(jìn)水。常用核酸提取技術(shù)介紹核酸提取的質(zhì)量控制DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。一般情況下同時(shí)檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。

純雙鏈DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）

常用核酸提取技術(shù)介紹核酸樣品的保存：核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)溫度：4℃（5℃）最佳和最簡單-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存保存介質(zhì)：TE緩沖