大豆胞囊線蟲誘導的胰蛋白酶抑制劑基因表達分析

大豆顆粒是世界上大豆生產的毀滅性病原體。主要分布在中國、美國、巴西、加拿大、俄羅斯、日本等國家，對大豆生產危害較大。盡管采用化學防治和生物防治等措施防治大豆胞囊線蟲病取得了一定進展,但選育抗病品種(系)仍然是防治大豆胞囊線蟲病最經濟有效的方法,而挖掘大豆胞囊線蟲抗性基因是進行分子輔助育種的基礎。植物蛋白酶抑制劑是廣泛存在于植物界的一類天然抗蟲物質,具有廣譜抗蟲的特點。大豆籽粒中含有多種類型蛋白酶抑制劑,其中Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(KTI)是優勢類型,在種子形成過程中進行優勢表達,根、莖、葉中也有少量存在。大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑類型,可抑制不同來源的胰蛋白酶活性,阻礙病原物對蛋白質的消化吸收。因此,大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑在植物抗蟲、抗病基因工程中具有廣泛的應用價值。趙洪錕等利用RT-PCR方法從高抗蚜蟲的多年生野生大豆短絨野大豆未成熟子葉中擴增到了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑同源基因單一目的片段。本研究利用RT-PCR技術獲得了高抗大豆胞囊線蟲品種灰皮支黑豆的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的序列,并利用Real-TimeQuantitativePCR技術研究了大豆胞囊線蟲3號生理小種脅迫下Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因在抗、感大豆品種根系內的相對表達量,為明確胰蛋白酶抑制劑基因在大豆抗胞囊線蟲機制中的作用奠定基礎。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1大豆品種抗大豆胞囊線蟲品種灰皮支黑豆(ZDD2315)和感大豆胞囊線蟲品種遼豆15均為沈陽農業大學北方線蟲研究所保存資源。1.1.2綠線癥1.2測試方法1.2.1根系總氮的提取取沖洗干凈的灰皮支黑豆幼嫩根系,使用AXYGEN公司的TotalRNAMiniprepKit提取根系的總RNA。1.2.2國家檢測鈉質量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量,再利用Nanodrop紫外分光光度計測定RNA的濃度。1.2.3由于胰蛋白酶抑制劑基因的pcr擴增1.2.4pcr產物的純化及酶切檢測利用AXY-GEN公司的DNAGelExtractionKit回收純化PCR產物,利用克隆載體pGEM-Teasy將其克隆并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,挑取菌落進行PCR及酶切檢測。經鑒定的重組質粒送大連TaKaRa公司進行序列測定。1.2.5胰蛋白酶抑制劑基因表達將供試大豆種子用濕潤的醫用紗布包裹,置于培養皿中在25℃下催芽,期間及時換水。催芽后移至黑色塑料缽中(16cm×16cm),無菌土栽培。在大豆苗期接種大豆胞囊線蟲3號生理小種的卵懸液,每株大約2000粒卵。分別于接種后0、5、10、15、20、25、30d隨機取抗病品種灰皮支黑豆和感病品種遼豆15的根系,用清水沖洗干凈后,利用AXYGEN公司的TotalRNAMiniprepKit提取大豆根系的總RNA,然后再合成cDNA第一鏈。利用TIANGEN公司的RealMasterMix(SYBRGreen)進行胰蛋白酶抑制劑基因的熒光定量PCR檢測,PCR反應體系:cDNA模板5μL,2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution22.5μL,正向引物KTI12μL,反向引物KTI22μL,ddH2O18.5μL,以actin作內參基因。PCR反應條件:95℃3min;95℃30s,55℃30s,68℃1min,40個循環。引物均由上海英駿生物技術有限公司(Invitrogen)合成,序列為KTI1:5′-CTCCACAACAGACCACTCGG-3′,KTI2:5′-CCCCAACGGGAAATGAAAGA-3′;actin4-s:5′-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3′,actin4-a:5′-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3′。2結果與分析2.1總rna的完整性使用AXYGEN公司的TotalRNAMiniprepKit提取灰皮支黑豆根系的總RNA,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示,18S、28SrRNA完整(圖1),這表明RNA的完整性良好,未發生降解。經紫外分光光度計法檢測,RNA的OD260/OD280值為1.98,表明所提取RNA的純度和質量符合試驗要求。2.2胰蛋白酶抑制劑基因檢測以灰皮支黑豆根系的總RNA為模板,以Oligo(dT)15引導反轉錄合成cDNA,在優化反應條件的基礎上,利用特異性引物KTI-RTS和KTI-RTA擴增胰蛋白酶抑制劑基因,電泳結果顯示,RT-PCR獲得了500bp左右大小的特異性譜帶(圖2)。擴增產物回收后與pGEM-Teasy載體連接,進行克隆并測序,得到573bp的胰蛋白酶抑制劑基因的CDS序列。2.3大豆囊線蟲誘導下胰蛋白酶抑制劑基因的形成分析2.3.1總rna的提取和紫外分光光度計法檢測高質量的RNA對于反轉錄合成cDNA和熒光定量PCR都非常重要,本研究利用AXYGEN公司的試劑盒提取大豆根系的總RNA,紫外分光光度計法檢測各樣品RNA的質量濃度如表1所示,OD260/OD280值均在1.9~2.1,這表明RNA的純度和質量較好,符合熒光定量PCR試驗的要求。2.3.2胰蛋白酶抑制劑基因表達增加從圖3可以看出,抗病品種灰皮支黑豆和感病品種遼豆15在大豆胞囊線蟲侵染前,根系內胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量相當。大豆胞囊線蟲侵染后10d,遼豆15根系內的胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量降低了50%,灰皮支黑豆根系內的胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量也略有下降,但其表達量仍高于遼豆15。大豆胞囊線蟲侵染后20d,遼豆15根系內的胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量達到最低值,而灰皮支黑豆根系內的胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量達到最高值,是遼豆15的5.8倍。大豆胞囊線蟲侵染后25d、30d,灰皮支黑豆根系內的胰蛋白酶抑制劑基因的相對表達量始終高于遼豆15,這表明胰蛋白酶抑制劑基因在灰皮支黑豆受大豆胞囊線蟲3號生理小種侵染后期的抗性反應中起關鍵作用。3植物蛋白酶抑制劑相對于植物蛋白酶抑制劑抗蟲方面的研究而言,關于植物蛋白酶抑制劑抗病作用的研究還比較少,但有研究表明,植物蛋白酶抑制劑與植物的抗病性有一定的關系。Peng等研究發現,致病疫霉(Phytophthorainfestans)感染番茄后,番茄葉片內胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑的含量迅速增高,而且抗病品種蛋白酶抑制劑的增加量明顯高于感病品種。Roby等觀察到,西瓜感染菜豆炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianw)后,葉片內的蛋白酶抑制劑含量上升。煙草疫霉(Phytophthoraparasitica)的培養物能誘導煙草細胞分泌胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶抑制劑。馬鈴薯蛋白酶抑制劑能夠抑制從病斑中分離出的病原微生物的生長。有研究表明,病原微生物在侵染與擴展的過程中,要依賴胞外蛋白酶降解寄主組織,才能獲得病原菌生長和繁殖所需的氨基酸,而植物則可能通過分泌蛋白酶抑制劑來阻止病原菌蛋白酶對寄主組織的降解,使病原菌營養不足,生長和繁殖受限,侵染與擴展受阻,從而達到抗病的目的。關于植物蛋白酶抑制劑在植物抗線蟲中的作用研究很少。楊少旭等比較了大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)在抗、感大豆品種接種大豆胞囊線蟲與未接種對照中的表達量,結果表明,在大豆胞囊線蟲侵入后,抗、感品種STI的表達量明顯高于未接種對照,推測STI參與了抗病過程。在根染色時發現,抗、感品種根內都有二齡幼蟲大量侵入,說明STI不能阻止大豆胞囊線蟲的侵入,但在后期調查時發現抗病品種的根部不形成胞囊或僅形成少量胞囊,推測STI可能抑制大豆胞囊線蟲的發育與繁殖?？勾蠖拱揖€蟲品種灰皮支黑豆是我國特有的優質抗源,其對大豆胞囊線蟲的抗性主要與抑制線蟲的生長發育有關,本研究結果顯示,胰蛋白酶抑制劑基因在灰皮支黑豆受胞囊線蟲侵染后期大量表達,說明其與大豆胞囊線蟲抗性相關,關于其在灰皮支黑豆抗胞囊線蟲的發育與繁殖中的作用機制還有待于進一步研究。大豆胞囊線蟲3號生理小種采自沈陽農業大學試驗地。參照TIANGEN公司的cDNA合成系統,以Oligo(dT)15為引物,利用高效的QuantReverseTranscriptase將提取的根系總RNA合成cDNA第一鏈。PCR反應體系:cDNA模板2μL,10μmol/LKTI-RTS1μL,10μmol/LKTI-RTA1μL,2×TaqPCRMasterMix12.5μL,滅菌ddH2O8.5μL。PCR反應條件:94℃預變性2min;94℃變