食品微生物檢驗(yàn)的基本原理、方法和流程第二章一、微生物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備玻璃器皿的洗刷與準(zhǔn)備

潔凈劑及使用范圍洗滌液的制備及使用注意事項(xiàng)洗滌玻璃儀器的步驟與要求玻璃儀器的干燥玻璃器皿的包裝和滅菌實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備消毒與滅菌基本概念干熱滅菌濕熱滅菌其它消毒和滅菌方法消毒：是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法。滅菌：是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。滅菌設(shè)備蒸汽出口二、微生物實(shí)驗(yàn)操作2.1無菌操作的概念2.2酒精燈2.3接種針（環(huán)），制作，使用2.4移液管和加樣槍的使用2.5傾注平皿2.6液－液接種2.7平板劃線微生物接種工具和方法在微生物檢驗(yàn)中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

斜面接種技術(shù)無菌操作平板劃線三、微生物實(shí)驗(yàn)的觀察3.1顯微鏡觀察3.2平板菌落觀察3.3斜面培養(yǎng)物的觀察3.3液體培養(yǎng)物的觀察3.1顯微鏡觀察活菌觀察：懸滴法和壓滴法，運(yùn)動特性。染色：單染色，革蘭氏染色。

細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等發(fā)生變化。革

蘭

氏

染

色

法1.涂片固定2.單染—結(jié)晶紫染液第一次染色

1min

3.媒染—碘-碘化鉀溶液浸濕30S4.脫色—95%乙醇溶液進(jìn)行顏色洗脫5.復(fù)染—紅色的藩紅染液第二次染色

呈現(xiàn)第二次染色的效果紅色；稱革蘭氏陰性菌（紅陰G-）細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的效果紫色，革蘭氏陽性菌（紫陽G＋）；3.2平板菌落觀察大小形狀色澤邊緣透明度濕潤度溶血性大腸桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂上生長表現(xiàn)3種菌落形態(tài)：（1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。（3）粘液型：常為含有莢膜的菌株。菌落形態(tài)學(xué)

BacterialColonyMorphology有莢膜的細(xì)菌菌落較大并且表面光滑，而沒有莢膜的則表面較粗糙；具有芽孢的細(xì)菌菌落表面常有褶皺并且不透明。沒有鞭毛不運(yùn)動的細(xì)菌，特別是球菌，常形成較小、較厚、邊緣較整齊的菌落；有鞭毛的細(xì)菌則較大而扁平，邊緣波狀、鋸齒狀等；蠟樣芽孢桿菌菌落枯草芽孢桿菌菌落光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落3.3斜面培養(yǎng)物的觀察

絲狀樹狀念珠狀擴(kuò)展?fàn)罴俑鶢畲堂珷?.4液體培養(yǎng)物的觀察

未接種形成薄膜形成沉淀混濁生長絮狀生長①對氧氣要求：專性需氧菌微需氧菌兼性厭氧菌專性厭氧菌②對CO2要求：5%CO2①水②碳源③氮源④無機(jī)鹽⑤生長因子有些細(xì)菌需要培養(yǎng)微生物4、對氣體要求3、PH2、溫度1、營養(yǎng)物質(zhì)微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的氧氣條件培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵——搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。厭氧培養(yǎng)：除了最簡便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖——美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧條件生物學(xué)方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強(qiáng)，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低。化學(xué)方法：利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應(yīng)時吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達(dá)到嚴(yán)格厭氧目的，常采用物理和化學(xué)相結(jié)合并用的方法。微生物的培養(yǎng)

－－微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)美蘭氧化還原指示劑：0.006NNaOH0.015%美蘭溶液6％葡萄糖溶液上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小３Ｒ姷纳磻?yīng)：根據(jù)細(xì)菌具有不完全相同的酶，分解不同營養(yǎng)物質(zhì)的特點(diǎn)，用生化方法來鑒定細(xì)菌。對糖的發(fā)酵對蛋白質(zhì)的發(fā)酵枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)甲基紅（MR）試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)VP試驗(yàn)其他試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)糖酵解試驗(yàn)

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用（產(chǎn)酸）或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。葡萄糖：七葉苷：淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。V-P試驗(yàn)

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。甲基紅（MethylRed）試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅（+）；如酸性物質(zhì)進(jìn)一步分解，會使pH上升在5.4以上，使甲基紅指示劑變黃（-）。靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物（+）；無色則為陰性。含硫有機(jī)物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分細(xì)菌分解產(chǎn)生H2S，

H2S和培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽反應(yīng)，形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉淀。硫化氫試驗(yàn)枸椽酸鹽試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色（+）；陰性則不變色（綠色）。接種硝酸鹽肉湯，35℃培養(yǎng)5天，加入0.2ml試劑A（對氨基苯磺酸），再加入

0.2ml試劑B（α-萘胺），輕搖混合。紅色：陽性沒有顏色變化：加入少量鋅粉－變紅－陰性（硝酸鹽未被還原）－不變－陽性（亞硝酸鹽已經(jīng)分解成氨和氮）硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：某些微生物可以將硝酸鹽還原成亜硝酸鹽，在酸性條件下，轉(zhuǎn)化為亞硝酸，與指示劑結(jié)合，呈紅色（+）。菌落－平板－1滴3％的過氧化氫。陽性則產(chǎn)生大量氣泡。過氧化氫酶：過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解成水和氧。氨基酸脫羧酶試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,可使賴氨酸、鳥氨酸生產(chǎn)脫羧作用,生成胺類物質(zhì)和CO2。胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細(xì)菌。血漿凝固酶試驗(yàn)原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性動力觀察：MOTILITYTEST

1.Pseudomonasaeruginosa（銅綠假單胞菌）：Motile

2.Staphylococcusaureus：Non-motile

3.Bacillussubtilis：Motile

PrincipleTheloweragarconcentrationinthemediumallowslimitedmovementofmotilebacteriafromtheareaofthestab.Motilitywillbedetectableasdiffusegrowthradiatingfromthestabline.Aspecialdye,atetrazoliumsalt(TTC)maybeaddedtomaketheradiatinggrowthmorevisibleasthereddishdiffusearea.

IMViC試驗(yàn)IMViC就是：?I－吲哚（indol

test）

?

M－甲基紅（methyl

red

test）

?

V－V-P（Voges-Prolauer

test）

?

C－檸檬酸鹽（citrate

test）

這四個生化試驗(yàn)，合稱

IMViC試驗(yàn)，主要用于腸道菌鑒定。血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。血清學(xué)試驗(yàn)O抗原：存在于細(xì)胞壁脂多糖（LPS）層，具有屬、種特異性。其特異性取決于LPS分子末端重復(fù)結(jié)構(gòu)多糖鏈的糖殘基種類的排列。O抗原耐熱，100℃不被破壞。H抗原：存在于鞭毛蛋白。不耐熱，60℃30分鐘即被破壞。H抗原的特異性決定于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間結(jié)構(gòu)。細(xì)菌失去鞭毛后，運(yùn)動隨之消失；同時O抗原外露，是為H-O變異。莢膜或包膜抗原：位于O抗原外圍，能阻止O凝集現(xiàn)象。多糖性質(zhì)，但60℃30分鐘可去除之。毒力抗原（Vi抗原，Vi＝Virulence）Viantigen：定位于革蘭氏陰性細(xì)菌菌體抗原（O抗原）外側(cè)的易熱抗原。一般認(rèn)為與毒力有關(guān)，因此稱為毒力抗原。與氯化鐵起反應(yīng)，可用電子顯微鏡證實(shí)其存在。一般認(rèn)為毒力抗原由N-乙酰氨基糖醛酸的聚合物組成，在血清學(xué)上可與其他表面抗原區(qū)別開來。抗原種類：

鞭毛抗原（H）菌體抗原（O）K或Vi抗原三、微生物學(xué)檢驗(yàn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：

運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的儀器設(shè)備、試驗(yàn)器材，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法項(xiàng)目要求快速、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)?zāi)康木z驗(yàn)的范圍：生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)：水、空氣、地面、墻壁原材料的檢驗(yàn)：包括添加到食品中的所有材料

食品加工、運(yùn)輸、貯存、銷售過程中的檢驗(yàn)：從業(yè)人員、材料、工具、設(shè)備的衛(wèi)生

食品本身的檢驗(yàn)：半成品及出廠的產(chǎn)品、中毒的產(chǎn)品、值得懷疑的產(chǎn)品。

食源性疾病中食品樣品食品安全事件中食品樣品

微

生物檢驗(yàn)流程（一）、樣品的采集取樣意義（目的）監(jiān)督管理（企業(yè)、執(zhí)法機(jī)構(gòu)等）為某一特殊目的（如食源性疾病、食物中毒、不明原因的疾病）搜索證據(jù)。采樣原則：確保所采集的樣品具有代表性抽樣堅(jiān)持隨機(jī)原則采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能外來污染。保存和運(yùn)輸?shù)倪^程，防止樣品中原有微生物的數(shù)量和質(zhì)量變化，保持樣品的原有狀態(tài)。1、采樣的原則

——具有代表性代表采樣當(dāng)時的及樣品整體的基本情況（隨機(jī)性、均勻性和數(shù)量）代表樣品整體中微生物的數(shù)量、種類和活力（生長能力）（如防止外源性污染）代表樣品整理的質(zhì)量（理化性質(zhì)），如防止樣品變質(zhì)。

2、采樣方案

采樣方案：在采樣計劃的基礎(chǔ)上，制定的采樣實(shí)施細(xì)則，包括用具的準(zhǔn)備、人員安排、采樣過程質(zhì)量控制、運(yùn)輸送樣安排等。在采樣方案中，用于分析的樣品的代表性是至關(guān)重要的，即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。按照相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定執(zhí)行。各取樣點(diǎn)原料：原始材料、添加劑、輔助材料及生產(chǎn)用水等；生產(chǎn)線樣品：食品生產(chǎn)過程中不同加工環(huán)節(jié)所取的樣品；庫存樣品：測定保質(zhì)期樣品質(zhì)量市場樣品：測定流通過程中微生物變化口岸樣品：除了滿足合同條款外，還有滿足進(jìn)口國相關(guān)法律規(guī)定。可疑食品樣品（包括食源性疾病和食物中毒等）各種取樣方案進(jìn)出口貿(mào)易合同對食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣。

合同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗(yàn)的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定抽樣方案。參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。參照GB4789.1《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

總則》。采樣類型基本原則（1）各種微生物本身對人的危害程度各有不同。（2）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度。根據(jù)（1）（2）的情況來設(shè)定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。采樣方案：分為二級和三級采樣方案。幾個字母代號n：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)；m：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值；M：微生物指標(biāo)的最高安全限量值。表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。二級抽樣方案二級法只設(shè)有n、с及m值以其一點(diǎn)作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。以生食海產(chǎn)品魚為例n=5，c=0，m=102，n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級抽樣方案

三級抽樣方案三級法有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個限量，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在m～M值之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在m～M值之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值者，則