第三章常用生物化學檢驗技術第一節光譜分析技術分光光度技術的基本原理分光光度計的基本結構分光光度計的操作方法分光光度技術的定性和定量方法按波長區域分1、紫外光譜：波長范圍：200—400nm2、可見光譜：波長范圍：400—760nm3、紅外光譜：波長范圍：760—1000nm200—------400—---------760—---1000nm紫外譜光可見光譜紅外光譜光譜分析技術：利用物質的吸收光譜、發射光譜、散射光譜特征對物質進行定性、定量分析的技術。吸收光譜（absorptionspectrum）即物質對不同波長光的吸收程度不同而產生的光譜。發射光譜是由物質分子或原子吸收了外來的能量后發生分子或原子間的能級躍遷而產生的光譜。分類吸收光譜分析法：1、可見分光光度法、測定有色物質2、紫外分光光度法、測定無色物質3、紅外分光光度法、測定物質結構發射光譜分析法1、火焰光度法、測定離子2、熒光法散射光譜分析法比濁法彩虹，又稱天虹，簡稱虹，是氣象中的一種光學現象，當太陽光照射到半空中的水滴，光線被折射及反射，在天空上形成拱形的七彩的光譜，彩虹的七彩顏色究竟是哪七種有不同的說法，東亞、中國對於七色光來說最普遍的說法是（從外至內）：紅、橙、黃、綠、青、藍、紫或紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫，而西方常用的排色則為后者去掉靛色而成為六色。一、分光光度技術的基本原理（一）、光的吸收現象和吸收曲線互補色光：兩種顏色的光，按適當的強度、比例混合后可成為白色的光，這兩種色光成為互補色光。朗伯-比爾定律：

I0：入射光強度C:溶液濃度

b:液層厚度I:透射光強度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系數bI0I（二）、光吸收定律三、分光光度計的基本結構最常用的是可見分光光度計和紫外-可見光分光光度計

光源單色器比色杯檢測器顯示器五大部份結構：（一）光源光源定義：指一種可以發射出供溶液或吸收物質選擇性吸收的光。光源應在一定光譜區域內發射出連續光譜，并有足夠的強度和良好的穩定性，在整個光譜區域內光的強度不應隨波長有明顯的變化。光源種類：可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。

紫外光光度計常用氫燈作為光源。（二）單色器定義：將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分光系統或單色器。種類：濾光片棱鏡光柵（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成

（五）顯示器（四）檢測器檢測器是將透過溶液的光信號轉換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。721可見分光光度計

722系列可見分光光度計

SP-756P紫外可見分光光度計TENSOR系列紅外光譜儀

四、分光光度技術的定量測定方法測定原理1.物質對光線有選擇性吸收作用。2.每種物質都具有其特征性的吸收光譜。3.在一定條件下，物質對光的吸收程度與該物質的濃度成正比。

（一）對比法（標準對照法）

實際測定過程中，用一已知濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據前式計算。A標準=ε標準C標準L標準

A樣品=ε樣品C樣品L樣品

A：吸光度；ε：摩爾吸光度；C：溶液濃度；L：液層厚度因標準液和樣品液中溶質為同一物質，

ε樣品=ε標準因盛標準液和測定液的比色杯徑長相同L樣品=L標準故上二式可寫成：A標準/A樣品=ε標準C標準/ε樣品C樣品

C樣品=A樣品/A標準×C標準（2）標準曲線法

配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標，吸光度為縱座標，在方格座標紙上作圖得標準曲線，根據測得吸光度值從標準曲線上讀得測定物的濃度。

標準曲線使用注意事項①標準曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。②吸光度在0.05-1.0范圍內。③所作標準曲線僅供短期使用。④標準曲線制作與測定管測定應在同一臺儀器上進行，避免誤差產生。應用中注意的問題①Lambert-beer’slaw的偏離：該定律只適應于一定濃度范圍，稀溶液能很好的服從該定律，A宜在0.05～1.0之間，超過該范圍→偏離→計算結果與實際濃度不相符②選擇波長：最大吸收波長，因為a.靈敏；b.避免雜質干擾③參比溶液（空白管）：消除背景效應，應包含除待測溶質以外所有的成分。

空白管：

測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會產生一定的光吸收，故設置一個空白管，即其中除了待測溶質以外，其它的成分完全相同。測量時，首先以空白管對準光路對儀器調零，既消除比色皿本身對光的吸收，又消除了非待測物對光的吸收，所測值即為待測物造成的光吸收?；鹧婀舛确ǖ亩x火焰光度法是以火焰為激發光源，用光電檢測系統測量被測元素所發射的輻射強度來進行定量分析的方法。它是一種簡化的發射光譜分析法。

火焰光度分析法火焰光度法是以火焰為激發光源，用光電檢測系統測量被測元素所發射的輻射強度來進行定量分析的方法。它是一種簡化的發射光譜分析法。特點①快速：試樣溶液于數分鐘內可完成測定。②準確：火焰光源穩定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析。③靈敏：分析堿金屬與堿土金屬，絕對靈敏度可達0．1～10×10－6g。④設備簡單：被測試樣易被火焰激發，產生的譜線較簡單，且均在可見光區，故使譜線分離和測量的設備簡單。⑤應用范圍窄：主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測定。儀器裝置（1）FP640火焰光度計

火焰光度法分析示意圖1.光源系統2.光學系統3.檢測系統（一）、基本原理火焰光度法的定量原理與發射光譜相同。即：試樣