微生物在各行業生產中的應用

實驗5-1酸乳的制作實驗5-2甜酒釀的釀制實驗5-3谷氨酸發酵實驗5-4乙醇發酵試驗實驗5-5阿維菌素發酵實驗5-6單細胞蛋白生產實驗5-7纖維素分解實驗5-8有機磷農藥的生物降解實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

實驗5-1酸乳的制作一、實驗目的學習酸乳的制作方法。二、實驗原理酸乳是以牛乳為主要原料，接入一定量乳酸菌，經發酵后而制成的一種乳制品飲料。當乳酸菌在牛乳中生長繁殖和產酸至一定程度時，牛乳中的蛋白質就凝結成塊狀。它具有清新爽口的味覺。由于酸乳中含有乳酸菌的菌體及代謝產物，它對腸道內的致病菌有一定的抑制作用，故對人體的腸胃消化道疾病也有良好的治療效果。通過本實驗學習制作酸乳和成品質量的評定。

實驗5-1酸乳的制作三、實驗材料

1.酸乳菌種市場銷售的各種酸乳。

2.培養基酸乳發酵培養基（市場銷售的牛乳）。

3.其他無菌血漿瓶(250mL)，恒溫水浴鍋，培養箱，冰箱等。四、實驗方法

1.配復原牛奶：用市售鮮牛奶加入5～6%蔗糖調勻即可。

2.裝瓶：在250mL的血漿瓶中裝入牛乳200mL。

3.消毒：將裝有牛乳的血漿瓶置于80℃恒溫水浴鍋中用巴氏消毒法消毒15min，或者置于90℃水浴中消毒5min即可。

實驗5-1酸乳的制作

4.冷卻：將已消毒過的牛奶冷卻至45℃。

5.接種：以5～10%接種量將市售酸乳接種入冷卻至45℃的牛奶中，并充分搖勻。

6.培養：把接種后的血漿瓶置于40～42℃溫箱中培養3～4h(培養時間視凝乳情況而定)。

7.冷藏：酸乳在形成凝塊后應在4～7℃的低溫下保持24h以上(稱后熟階段)，以獲得酸乳的特有風味和較好的口感。

8.品味：酸乳質量評定以品嘗為標準，通常有凝塊狀態、表層光潔度、酸度及香味等數項指標，品嘗時若有異味就可判定酸乳污染了雜菌。

實驗5-1酸乳的制作五、實驗報告記錄各批混菌發酵的酸乳品評結果，包括凝乳情況、口感、香味、異味、pH。注意事項：在酸乳發酵及傳代中應避免雜菌污染，特別是芽孢桿菌的污染，否則可導致酸乳產生異味。返回實驗5-2甜酒釀的釀制

一、實驗目的學習甜酒釀的釀制方法。二、實驗原理釀制甜酒釀的原理十分簡單，即將煮熟的米飯經接種酒釀種曲后，在適宜的培養條件下讓種曲中的根霉孢子萌發成菌絲體；經大量繁殖后通過淀粉酶的作用將淀粉轉化為葡萄糖，此為根霉的糖化階段。然后，再由根霉或種曲中所含的酵母菌或野生酵母菌繼續將糖化后的部分葡萄糖轉化為乙醇，經后熟使甜酒釀具有獨特的甜醇口味。實驗5-2甜酒釀的釀制

三、實驗材料

1.菌種來源“濃縮甜酒藥”(滬產)或蘇州等地產“甜酒藥”、“幽白藥”或小曲。

2.培養基糯米飯，馬鈴薯葡萄糖培養基。

3.其他研缽，培養皿，試管，移液管，接種環等。四、實驗方法

1.選擇原料：釀制甜酒釀的原料常用糯米，選擇時，力求用品質好、米質新鮮的糯米。

2.淘洗和浸泡：將米淘洗干凈后浸泡過夜，使米粒充分吸水，以利蒸煮時米粒分散和熟透均勻。實驗5-2甜酒釀的釀制

3.蒸煮米飯：將浸泡吸足水分的糯米撈起，放在蒸鍋內擱架的紗布上隔水蒸煮，至米飯完全熟透時為止。

4.米飯降溫：將蒸熟的米飯從鍋內取出，在室溫下攤開冷卻至80℃左右待接種。

5.接入種曲：按干糯米重量換算接種量。市售“甜酒藥”每包能釀制3kg糯米；而滬產“濃縮甜酒藥”每包可接1.5～2kg糯米。為使接種時種曲與米飯拌勻，可先將酒藥塊在研缽中搗碎，或再拌入一定數量的炒熟面粉后再與大量米飯混勻。實驗5-2甜酒釀的釀制

6.裝壇發酵：接種拌勻后的米飯可裝壇子發酵（通常應在壇子的中軸留一散熱孔道）。所用的容器都應預先洗凈，并用開水澆淋浸泡過，以殺死大部分雜菌。

7.保溫發酵：溫度可控制在30℃左右，發酵初期可見米飯表面產生大量縱橫交錯的菌絲體，同時糯米飯的粘度逐漸下降，糖化液漸漸溢出和增多。若在發酵中米飯出現干燥時，可在培養18～24h補加一些涼開水。

8.后熟發酵：釀制48h后的甜酒釀已初步成熟，但往往略帶酸味。如在8～10℃條件下將它放置2～3天或更長一段時間進行后發酵，則可去盡酸味。

9.質量評估：釀成的甜酒釀應是酒香濃郁、醪液充沛、清澈半透明和甜醇爽口的。實驗5-2甜酒釀的釀制

五、實驗報告從甜酒釀的外觀（酒釀醅團塊、醪液量及色澤和粘稠度等）和香味、口感等方面記錄和評估自己實驗的質量。注意事項淘洗的糯米要待充分吸水后隔水蒸煮熟透，使飯粒飽滿分散，利于接種后的根霉孢子能在疏松通氣的條件下良好地生長繁殖，使淀粉充分糖化。返回實驗5-3谷氨酸發酵

一、實驗目的

1.了解谷氨酸發酵的工藝過程。

2.學習用紙上層析法與比色法對谷氨酸進行定性與定量測定。二、實驗原理利用細菌生產谷氨酸是微生物好氧發酵的一個很典型的代表，谷氨酸發酵主要采用糖質原料，也可以用乙酸或乙醇等作原料。在使用糖質作原料時，葡萄糖在谷氨酸產生菌的各種酶系作用下，經己糖酵解、單磷酸己糖、三羧酸循環、乙醛酸循環等途徑生成谷氨酸、CO2和水。實驗5-3谷氨酸發酵

谷氨酸生產菌主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、微桿菌屬和節桿菌屬的細菌。目前生產上用得較多的是優良菌株黃色短桿菌T6-13。由斜面試管保藏的原菌出發，要繁殖成能夠供大規模生產所需的數百以至數千升種子的數量，必須經過若干次擴大培養后才能達到。一般的擴大培養工藝流程為：試管斜面原菌→試管斜面活化培養→三角瓶搖床培養(一級種子)→種子罐培養(二級種子)。本實驗中使用一級種子。實驗5-3谷氨酸發酵

三、實驗材料

1.菌種黃色短桿菌T6-13。

2.培養用原材料葡萄糖，玉米漿，尿素，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，硫酸亞鐵，瓊脂。

3.儀器和試劑接種環，酒精燈，試管，三角瓶，燒杯，恒溫培養箱，恒溫培養室，搖床，分光光度計，層析缸，新華一號濾紙，標準谷氨酸，0.5%茚三酮，正丁醇，甲酸，氨水，乙醇，硫酸鈉。實驗5-3谷氨酸發酵

四、實驗方法

1.T6-13菌種的擴大培養

(1)培養基的制備①試管斜面培養基葡萄糖0.1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH6.8～7.2。除瓊脂外，先將其余各成分溶解于水，調整pH后加入瓊脂并使之融化，分裝試管，一般培養基的裝量是試管容量的1/5。以111℃蒸汽滅菌10min，取出后趁熱制成斜面，放冷，斜面的長度為試管長度的1/2～3/5。實驗5-3谷氨酸發酵

②三角瓶擴大培養基葡萄糖2.5%，玉米漿2.5%，尿素0.5%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸鎂0.04%，硫酸錳2mg/kg，硫酸亞鐵2mg/kg，pH7.0。

(2)接種與擴大培養①將試管斜面T6-13菌種接種于試管活化斜面培養基上，以30～33℃培養24h。②將培養好的斜面菌種接一環于三角瓶擴大培養基中，32～34℃搖床振蕩培養10～12h。實驗5-3谷氨酸發酵

2.谷氨酸發酵試驗

(1)培養基的制備同種子培養基的制備。將制備好的滅菌培養基在無菌條件下分裝于已經滅過菌的500mL三角瓶中，每瓶裝100mL。

(2)接種與發酵將培養好的成熟種子接種于上述發酵培養基中，接種量為1%～2%。發酵溫度控制：0～16h為32～34℃，16h后為34～36℃。發酵液pH控制：0～12h為7.1～7.4，12～28h為7.1～7.3，28h后適當降低，一般為7.0以下，收瓶前為6.4～6.7。發酵時間控制：34～36h。實驗5-3谷氨酸發酵

3.谷氨酸定性鑒定用紙上層析法定性測定發酵產物中的谷氨酸。

(1)展開劑配方酸向展開：正丁醇∶88%甲酸∶水=15∶3∶2

堿向展開：正丁醇∶12%氨水=13∶2

(2)顯色劑：0.5%茚三酮。

(3)以標準谷氨酸與樣品相比。實驗5-3谷氨酸發酵

4.谷氨酸定量測定(用比色法)

(1)將上述定性測定的層析斑點剪下，投入盛有6mL洗脫劑的容器中(75%乙醇39份+0.2%硫酸鈉1份)，洗脫1h。將洗脫液在波長520nm處進行比色。

(2)以同一濾紙上無斑點處剪一塊與層析斑同樣大小的濾紙做空白對照，用同樣的方法進行洗脫處理。

(3)繪制標準谷氨酸工作曲線。①點樣：取10cm×10cm新華一號濾紙，在距底邊2cm處用鉛筆畫一直線，在直線上每隔2cm處，分別以2、4、6、8、10μL標準谷氨酸準確點樣。實驗5-3谷氨酸發酵

②依法進行展開、顯色、洗脫、比色。③以所測得的光密度為縱坐標，以谷氨酸的含量為橫坐標做圖，即得谷氨酸工作曲線。五、實驗報告繪制標準曲線，記錄實驗結果，并計算谷氨酸的產量。返回實驗5-4乙醇發酵試驗

一、實驗目的

1.熟識酵母菌的擴大培養技術。

2.掌握淀粉質原料發酵乙醇的技術。

3.學會測定乙醇發酵力的方法。二、實驗原理在無氧條件下，酵母菌利用己糖發酵生成乙醇和CO2的作用，稱為乙醇發酵。目前乙醇發酵所采用的微生物主要是酵母菌。生產上所使用的酵母菌原菌一般是固體斜面試管菌種，由于其酵母數量太少，不夠生產之需，所以必須將斜面菌種進行若干次的擴大培養，以獲得含有足夠數量酵母菌的酵母培養物，以供乙醇發酵之用，故被稱為酒母。實驗5-4乙醇發酵試驗

本實驗由于所用的發酵容器是三角瓶，故采用的擴大培養流程為：固體斜面試管原菌—→固體斜面試管活化菌種—→液體試管培養—→小三角瓶培養—→大三角瓶發酵。酵母菌的厭氧乙醇發酵是生產乙醇及各種酒類的基礎，因此學會乙醇酵母的擴大培養技術及其乙醇發酵方法是發酵微生物學的一項重要任務和基本功。另外，通過測定發酵過程中CO2生成量和最終產物乙醇的生成量，可以測定酵母的發酵能力。實驗5-4乙醇發酵試驗

三、實驗材料

1.菌種K氏酵母菌或1308號酵母菌。

2.試驗用原材料麥芽，甘薯粉或木薯粉，細菌淀粉酶，瓊脂。

3.儀器設備接種環，酒精燈，試管，三角瓶，燒杯，水浴鍋，恒溫培養箱，蒸餾燒瓶，冷凝管，牛角管，容量瓶，量筒，電爐，石棉鐵絲網，0～30%(體積分數)乙醇，0～50℃溫度計，0～100℃溫度計。實驗5-4乙醇發酵試驗

四、實驗方法

1.酵母菌的擴大培養

(1)培養基的制備酵母擴大培養中的試管和三角瓶培養用的培養基通常采用麥芽汁，其制備方法如下：將干麥芽磨碎，加入3.5倍量的65℃的熱水，在58～60℃的溫度下糖化3～4h，以碘液檢查糖化完全后，將其煮沸、過濾，將濾液濃度調整到13oBx。實驗5-4乙醇發酵試驗

將上述制備好的麥芽汁進行分裝并滅菌：①固體斜面試管培養基：取100mL麥芽汁，加入2%瓊脂，融化后分裝試管，一般培養基的裝量是試管容量的1/5。以121℃蒸汽滅菌20min，取出后趁熱置成斜面，放冷，斜面的長度為試管長度的1/2～3/5。②液體試管培養基：用稀硫酸將麥芽汁pH調節至4～4.4，分裝于試管中，每支試管裝5mL。以121℃蒸汽滅菌20min。③小三角瓶培養基：將pH調節至4～4.4的麥芽汁分裝于容量為150mL的三角瓶中，每瓶裝50mL。以121℃蒸汽滅菌20min。

實驗5-4乙醇發酵試驗

(2)接種與擴大培養①將斜面試管酵母原菌移接于固體斜面試管，于28～30℃下培養48h。②將上述培養好的斜面活化酵母菌種接一環于液體試管中，以28～30℃培養24h。③將上述液體試管酵母接種于小三角瓶中(每支試管接一個三角瓶)，以28～30℃培養至對數期末(約16h)。

(3)種子(酒母)質量要求對培養好的三角瓶種子要進行質量檢查。鏡檢時要求酵母形態健壯整齊，細胞內原生質稠密，無雜菌；細胞數0.8～1.0×108個/mL，出芽率20%～30%，死亡率小于1%。

實驗5-4乙醇發酵試驗

2.淀粉原料的蒸煮與糖化

(1)按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比，用50～55℃的溫水與淀粉原料攪拌混合，添加原料量0.1%的細菌淀粉酶，于電爐上加熱并不斷攪拌，升溫至90～93℃，保持5～10min，進行液化；繼續加熱煮沸lh，使淀粉充分糊化和液化，并適量補充水分。

(2)將上述蒸煮醪冷卻至60～62℃，添加180u／g原料的糖化酶，用硫酸將醪液的pH調節至4～4.5，在水浴鍋上保溫糖化30min，而后分裝于1000mL的三角瓶中，每瓶裝糖化醪500mL。

(3)糖化醪的質量要求：糖度15～17°Bx，還原糖6%～9%，pH4～4.5。實驗5-4乙醇發酵試驗

3.糖化醪的發酵將培養成熟的小三角瓶酵母種子(酒母)以無菌操作接入裝有500mL糖化醪的大三角瓶中(每個小三角瓶中接一個大三角瓶)，在30℃的溫度下發酵68～72h。

4.CO2生成量的測定測定乙醇發酵中CO2生成量的裝置如圖5-1所示。其測定方法如下：

(1)發酵前，將三角瓶外壁擦干，置于1/100g的天平上稱重，記下質量為m1。

(2)發酵完畢后，將三角瓶輕輕搖動，使CO2盡量逸出。在同一架天平上再稱重，記下質量為m2。

(3)CO2生成量=m1－m2。實驗5-4乙醇發酵試驗

5.乙醇度的測定

(1)按圖5-2所示安裝好蒸餾裝置。

(2)準確量取100mL發酵成熟醪倒入500mL蒸餾瓶中，并加入等量的蒸餾水。蒸餾瓶用插有溫度計的膠塞塞緊，連接好冷凝管，勿使漏氣。用電爐加熱，同時接通冷卻水，餾出液收集于100mL容量瓶中(如無容量瓶亦可直接用100mL量筒收集)。待餾出液達到刻度時，立即停止收集(注意：不能超過刻度)，倒入量筒中，稍加攪動，使之均勻，將酒精計與溫度計同時置入量筒，測定酒精度與溫度。

(3)根據測得的乙醇度與溫度，查換算表，得到溫度在20℃時的乙醇濃度。實驗5-4乙醇發酵試驗

圖5-1測定CO2生成量的裝置圖5-2蒸餾裝置

實驗5-4乙醇發酵試驗

五、實驗報告

1.記錄鏡檢酒母時看到的酵母形態，有無雜菌污染，酵母菌的數目。

2.發酵試驗中測得的CO2生成量。

3.蒸餾液的乙醇度，換算成標準溫度20℃的乙醇度。

返回實驗5-5阿維菌素的發酵

一、實驗目的學習阿維菌素的發酵過程二、實驗原理阿維菌素的發酵共分三大工序：菌種、發酵、提取。配合三個工序進行分析化驗和有關產物測定。衡量抗生素發酵液中抗菌物質的含量稱效價。抗生素效價測定可采用化學法或生物效價測定法。本實驗采用高效液相色譜法測定抗生素的效價。實驗5-5阿維菌素的發酵

三、實驗材料

1.菌株阿維菌素鏈霉菌斜面菌種。

2.培養基培養阿維菌素鏈霉菌所用的斜面培養基、分離培養基、種子培養基、發酵培養基。見附錄Ⅲ。

3.儀器及藥品接種環，培養皿，三角瓶，搖床，離心管，高效液相色譜柱，漩渦振蕩器，微孔濾膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，無菌水。實驗5-5阿維菌素的發酵

四、實驗方法

1.實驗用菌種的制備（1）單孢子懸液的制備向阿維菌素鏈霉菌孢子斜面中加入10mL無菌水，用接種環刮取孢子，震蕩打碎，過濾得到單孢子懸液。（2）自然分離將得到的單孢子懸液稀釋，分別涂布于含有分離培養基的平皿中，在28℃條件下培養7～9天。實驗5-5阿維菌素的發酵

2.發酵培養基和待檢測發酵液樣品的制備（1）水解淀粉的制備稱取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均勻，加熱使其糊化，降溫至60℃，然后在糊化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶，恒溫攪拌10min，最后加熱至沸騰狀態，保溫5min，使殘留的淀粉酶失活，降溫待用。（2）液體發酵鏟取面積為0.5×0.5㎝2大小的斜面培養物，將其接種至種子瓶的培養基中，28℃搖床培養22h后，按發酵搖瓶裝料體積的5%接種至發酵瓶中，28℃培養9天。實驗5-5阿維菌素的發酵

（3）檢測發酵液中阿維菌素樣品的制備取5mL搖瓶發酵液于離心管中，3000r/m離心10min，棄去上清夜。在發酵液的沉淀物（菌絲體）中加入2mL丙酮，在漩渦式混合器上震蕩1min，靜置10min，如此重復3次。然后加入3mL乙酸乙酯，震蕩1min，靜置10min，3000r/m離心10min，最后小心地吸取其中的上清夜作為樣品，待檢測。實驗5-5阿維菌素的發酵

3.阿維菌素含量的測定利用高效液相色譜法（HPLC）檢測（1）HPLC條件色譜柱：KromasilC185μm200×4.6mm流動相：CH2OH∶H2O﹦88∶12(V/V)流速：1.0mL/min檢測波長：244nm（2）標準曲線的測定配制一系列不同濃度的阿維菌素B1標準溶液（500～3000μg/mL），分別取各濃度標準溶液的過濾液5μL注入高效液相色譜儀中，測定其吸收峰值面積，然后對濃度（Y）和吸收峰面積（X）進行一元線性回歸，得到一元線性回歸方程。

實驗5-5阿維菌素的發酵

（3）效價的計算方法將乙酸乙酯萃取所得的上清夜用0.45μm的微孔濾膜過濾，準確吸取濾液5μl注入HPLC中，記錄色普圖，將B1峰面積代入上述的回歸方程中，計算得到發酵液中B1組分發酵單位（μg/mL）。

4.發酵液中菌體濃度的計算取體積為V1（mL）的發酵液，3000r/m離心10min后，得到上清夜的體積計量為，V2（mL），那么發酵液的菌體濃度為：菌體濃度＝[（V1－V2）/V1]×100%五、實驗報告繪制標準曲線，并記錄實驗結果。返回實驗5-6單細胞蛋白的生產

一、實驗目的了解單細胞蛋白的生產原理和單細胞蛋白的培養方法。二、實驗原理單細胞蛋白是通過培養單細胞微生物獲得的菌體蛋白質。酵母菌、絲狀真菌、微型藻類及非病源細菌等單細胞微生物均可用于生產單細胞蛋白，其中酵母菌是生產單細胞蛋白的主要單細胞微生物。多種原料可用于生產單細胞蛋白，如秸稈、薯干、石油、甲烷等，特別是一些工業廢水、廢渣可用來生產單細胞蛋白飼料，廢物利用有利于環保。實驗5-6單細胞蛋白的生產

三、實驗材料

1.菌種啤酒酵母。

2.菌種活化培養基黃豆芽10g，100mL水，煮沸30min,過濾，濾液加5g蔗糖，加水至100mL。

3.試劑廢水，瓊脂，蔗糖，尿素，磷酸二氫鉀。

4.器材接種環，無菌吸管，電磁攪拌器，離心機，搖床，超凈工作臺，高壓滅菌鍋。實驗5-6單細胞蛋白的生產

四、實驗方法

1.菌種活化用接種環將啤酒酵母菌種接入盛有35mL菌種活化培養基的三角瓶中，30℃搖床培養17～19h。

2.大量培養量取廢水加入錐形瓶中，加入0.5%的尿素和磷酸二氫鉀，調節pH6。用無菌吸管將活化的菌種0.5～1mL接入10mL上述廢水溶液，30℃搖床培養24h。

3.集單細胞蛋白將培養后的啤酒酵母懸液在3000r/min條件下離心8min，所得沉淀在95～105℃條件下烘干2h，即得產品。稱重。五、實驗報告記錄單細胞蛋白的產量。返回實驗5-7纖維素的分解

一、實驗目的

1.了解能分解纖維素的微生物種類。

2.了解環境中纖維素分解菌的種類及其降解能力。二、實驗原理每年均有大量纖維素物質作為廢棄物進入環境。纖維素的分解是自然界碳素轉化的重要環節。分解纖維素的微生物種類甚多，本實驗是主要培養并觀察在中溫有氧與缺氧條件下分解纖維素的微生物以及濾紙纖維素被分解的現象。實驗5-7纖維素的分解

三、實驗材料

1.培養基赫氏噬纖維菌基礎培養基，厭氧性分解纖維素細菌培養液。（見附錄III）

2.菌源菜園土、河溝底泥或水稻土。

3.其他液體石蠟，直徑9cm的無菌圓形濾紙。四、實驗方法

1.接種

(1)取無菌圓濾紙二張，分別置于二個赫氏纖維菌基礎培養基平板上，貼緊。

(2)取厭氧性分解纖維素細菌培養液二管。一管不接種，一管接入少許河底泥或水稻土。實驗5-7纖維素的分解

2.培養將上述培養皿置28～30℃，培養7～10天；上述試管置33～37℃，培養10～15天。

3.觀察

(1)濾紙被分解的情況：注意濾紙出現斑點或變薄，分解旺盛時可見到濾紙徹底潰爛狀。制片染色觀察：土粒周圍常長出深黃、金黃或黃綠色菌落，取帶黃色粘液的纖維少許于載玻片上，加無菌水一滴，將纖維散開，干燥固定，用齊氏石炭酸復紅染色。實驗5-7纖維素的分解

(2)試管濾紙條上?？梢娀疑胪该骰螯S色斑塊的纖維溶解區，即為厭氧性分解纖維素細菌菌落，同上述制片染色。油鏡下觀察，?？梢娨环N長桿菌，形成芽孢時，細胞末端膨大成鼓錘狀，此即分解纖維素能力很強的奧氏梭菌。五、實驗報告

1.描述(接種與不接種)培養皿及試管中濾紙的分解情況。

2.繪圖并記錄需氧及厭氧分解纖維的微生物的形態。

返回實驗5-8有機磷農藥的生物降解

一、實驗目的

1.掌握微生物的馴育技術。

2.了解微生物對有機磷農藥降解速率測定方法。二、實驗原理對硝基酚在堿性條件下以鹽的形式存在，在波長410nm處有強烈吸收峰，能夠通過分光光度計定量檢測。本實驗是以對硝基酚的生成量為指標，測定微生物對該有機磷農藥的降解速率。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

三、實驗材料

1.菌種sp.CTP－01(可由中國科學院水生生物研究所提供)。

2.培養基Burk無機鹽培養液

3.試劑5%對硫磷溶液，0.29%對硫磷溶液（對硫磷用丙酮配制），對硝基酚標準液(貯液)，對硝基酚工作液（見附錄Ⅴ），14%NaOH溶液。

4.儀器分光光度計，離心機，電動攪拌器，恒溫水浴，通氣泵，搖床等。

5.其他2000mL玻璃缸，250mL三角瓶，試管，吸管等。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

四、實驗方法

1.菌體的馴育與收集

(1)將Ps.CTP－01的斜面菌種接入裝有100mLBurk培養液的三角瓶中，加入0.01mL5%對硫磷溶液。置搖床上30℃培養5天。

(2)將培養5天的菌液全部接種于裝有2000mLBurk培養液的玻璃缸中，加入0.5mL對硫磷溶液。在通氣、攪拌條件下，30℃保溫培養。

(3)細菌生長過程中，由于對硫磷被細菌利用，使培養液顏色變黃，待黃色消失，再補加lmL5%對硫磷溶液。嚴格控制培養液的pH值，使其保持在7.5左右。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

(4)如果培養物生長迅速，可以觀察到培養液的顏色變化很快，就必須適當增加對硫磷補加量，一次可加入對硫磷原油1～3滴。按(3)的步驟反復補加與培養。直到培養液的混濁度在分光光度計波長500nm時，光密度達到0.2左右。

(5)離心收集菌體，轉速為4000r/min，離心20分鐘，收集菌體稱其濕重，并重新懸浮于50mL新鮮Burk無機鹽培養液中，定容至50mL，于4℃保存備用。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

2.對硫磷降解速率的測定

(1)取試管4支，分別加入l0mLBurk培養液及0.1mL0.29%對硫磷溶液，將試管于30℃恒溫水浴上保溫10分鐘。

(2)將其中3支試管分別加入0.2mL菌液，另1支加0.2mLBurk培養液，在加入菌液的同時開始計算反應時間，反應20分鐘。

(3)反應過程中經常搖動試管。

(4)反應結束應立即在分光光度計波長410nm時讀其光密度值。以未加菌液的試管為空白對照。

(5)結果取三個平行試驗的平均值。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

3.對硝基酚：標準曲線的制備：將對硝基酚工作液稀釋至8.34×10-4、6.95×10-4、5.56×10-4、4.17×10-

4、2.78×10-4、1.39×10-4mg/L的濃度，注意凋節pH至7.5。以蒸餾水為對照，在分光光度針波長410nm時測各稀釋液的光密度值(OD)。將測定結果繪制標準曲線，并求出曲線的斜率K。實驗5-8有機磷農藥的生物降解

4.對硫磷降解速率計算：反應液體積：培養液+底物量+菌液量菌體量：加入菌液的mL數換算成菌體的濕重實驗5-8有機磷農藥的生物降解

五、實驗報告將本次測試結果填入表5-1中。表5-1測試結果試管編號處理步驟1234Burk培養液（mL）0.29%對硫磷（mL）菌液量（mL）反應時間（min）OD410降解速率返回實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

一、實驗目的

1.觀察活性污泥（或生物膜）的微生物種類及性狀。

2.測定污泥沉降比及活性污泥（或生物膜）中動物的數目。

3.初步判斷污水處理的運行狀況是否正常。二、實驗原理活性污泥中生物相較復雜，以細菌，原生動物為主。還有真菌、后生動物等。某些細菌能分泌膠粘物質形成菌膠團，進而組成污泥絮絨體（絨粒）。實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

三、實驗材料

1.活性污泥（或生物膜）取自污水處理廠曝氣池

2.其他量簡（100mL），載玻片，蓋玻片，滴管，鑷子，計數板等。

3.儀器顯微鏡采用厚玻璃割成9cm長，4cm寬的長方形，玻璃厚度以0.3～0.4cm為宜。利用氫氟酸腐蝕法，使玻板中央刻上10×10=100個小方格，小方格的大小沒有嚴格規定，只要一片大號蓋玻片能蓋格子有余和便于在顯微鏡下計數就可以了。用大號蓋玻片切成寬約0.7cm的玻條，用阿拉伯樹膠粘在計數用的小方格的四周，便呈一周凸起的邊框。這樣，就制成了一塊微型動物計數板，如圖5-4、圖5-5。實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

圖5-4微型動物計數板

圖5-5微型動物計數板(側視)

1-蓋玻片2-計數室

1-蓋玻片；2-計數板；3-凸起的邊框；4-稀釋液

實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

四、實驗方法

1.測污泥沉降比（SV30）肉眼觀察，取曝氣池的混合液置于100mL量筒內，直接觀察活性污泥在量筒中呈現的絮絨體外觀及沉降性能。

2.觀察活性污泥生物相（1）制備水浸片取活性污泥混合液1～2滴于載玻片上，加蓋玻片制成水浸標本片。（2）低倍鏡觀察觀察生物相的全貌，要注意污泥結構松緊程度，菌膠團和絲狀菌的比例及生長狀況，觀察微型動物的種類及活動狀況。實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

①污泥絮粒污泥絮粒性狀是指污泥絮粒的形狀、結構、緊密度及污泥中絲狀菌的數量。鏡檢時可把近似圓形的絮粒稱為圓形絮粒，與圓形截然不同的稱為不規則形狀絮粒。絮粒中網狀空隙與絮粒外面懸液相連的稱為開放結構；無開放空隙的稱為封閉結構。絮粒中菌膠團細菌排列致密，絮粒邊緣與外部懸液界限清晰的稱為緊密的絮粒；邊緣界線不清的稱為疏松的絮粒。實驗5-9活性污泥中菌膠團及生物相的觀察

②絲狀微生物活性污泥中的絲狀菌數量是影響污泥沉降性能最重要的因素。當污泥中絲狀菌占優勢時，可從絮粒中向外伸展，阻礙了絮粒間的濃縮，使污泥SV30值和SVI值升高，造成活性污泥膨脹，根據污泥中絲狀菌與菌膠團細菌的比例，可將絲狀菌分成如下五個等級：0級：污泥中幾乎無絲狀菌存在；±級：污泥中存在少量絲狀菌；