選擇性必修三生物技術與工程第十單元生物技術與工程第5講基因工程考點一考點三考點二課標要求核心素養1．概述基因工程的誕生。2．闡明基因工程的原理及技術(含PCR技術)。3．舉例說明基因工程在農牧、食品及醫藥等行業的應用。4．概述蛋白質工程的原理及應用。5．活動：DNA片段的擴增及電泳鑒定。1.生命觀念：舉例說出基因工程的基本工具和基本操作程序。2．科學思維：嘗試建立基因工程的操作流程模型。3．社會責任：基因工程和蛋白質工程的應用。考點一重組DNA技術的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照_______________，通過_________等技術，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創造出更符合人們需要的新的__________和__________。(3)水平：_______________水平。由于在DNA分子水平上進行設計和施工，因此又叫作_______________技術。人們的愿望轉基因生物類型生物產品DNA分子重組DNA2．重組DNA技術的基本工具(1)限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)(2)DNA連接酶(3)載體易錯整合，判斷正誤。(1)基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。(

)(2)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA連接酶、載體等。(

)(3)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的氫鍵斷開。(

)

√

×

×(4)質粒上標記基因的存在便于重組DNA分子的篩選。(

)(5)基因工程中實際用到的質粒都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。(

)

√

√

1．限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？原核生物中存在限制酶的意義是什么？提示：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。2．DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？提示：不是。DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。3．天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程載體？為什么？提示：不可以。具有能自我復制、有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因及對受體細胞無害等特點的DNA分子才可以直接用作基因工程的載體。實際上天然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往需要進行人工改造后才能用于基因工程操作。1．基因工程的理論基礎2．圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstⅠ；為避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。特別提醒：(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產生4個黏性末端或平末端。(3)限制酶在識別序列中心軸線兩側切開形成的是黏性末端，而在識別序列中心軸線處切開形成的是平末端。3．與DNA有關的幾種酶的比較

作用對象作用部位作用結果限制酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA切成兩個或多個片段DNA連接酶DNA分子片段磷酸二酯鍵將兩個或多個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵以DNA單鏈為模板，將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA鏈上解旋酶DNA分子堿基對中的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈DNA酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA片段水解為脫氧核苷酸特別提醒：(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產生4個黏性末端或平末端。(3)限制酶在識別序列中心軸線兩側切開形成的是黏性末端，而在識別序列中心軸線處切開形成的是平末端。考向

限制酶和DNA連接酶(2022·天津六校聯考)如表列舉了幾種限制酶的識別序列及其切割位點(箭頭表示相關酶的切割位點)。如圖是酶切后產生的幾種末端。下列說法正確的是(

)例

1BA．BamHⅠ切割的是氫鍵，AluⅠ切割的是磷酸二酯鍵B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列產生的片段能夠相連，連接后的片段還能被Sau3AⅠ切割C．DNA連接酶能連接②⑤，不能連接②④D．E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接①③，且連接效率低解析：BamHⅠ與AluⅠ切割的均是磷酸二酯鍵，A錯誤；BamHⅠ切割

，Sau3AⅠ切割

，故二者切割后產生的黏性末端是相同的，因此二者切割后產生的黏性末端能夠相連，連接后能被Sau3AⅠ切割，但是不一定能被BamHⅠ切割，B正確；②、⑤的粘性末端相同，②、④的黏性末端也相同，因此DNA連接酶能連接②、⑤，也能連接②、④，C錯誤；E.coliDNA連接酶是從大腸桿菌中獲得的DNA連接酶，只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既可以連接黏性末端也可以連接平末端，而圖中①、③屬于平末端，只能用T4DNA連接酶連接，D錯誤。〔變式訓練〕1．限制性內切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的識別序列及切割位點分別為A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相關敘述正確的是(

)A．兩種限制酶是在同一種生物中分離出來B．兩種限制酶切割DNA形成的黏性末端的堿基序列都是AGCTC．用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割質粒后，目的基因和質粒能連接成重組質粒D．實驗中可通過控制反應時間、酶的濃度等控制酶切效果D解析：HindⅢ和XhoⅠ是從不同的微生物中分離得到的，A錯誤；兩種限制酶識別和切割的序列分別為A↓AGCTT和C↓TCGAG，則兩者切割后形成的黏性末端分別是—TCGA、—AGCT，B錯誤；兩種限制酶切割形成的黏性末端不同，無法形成重組質粒，C錯誤；實驗中可通過控制反應時間、酶濃度等控制切割效果，D正確。考向

基因工程載體的應用如圖是利用基因工程技術構建重組表達載體的過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制酶。下列相關敘述錯誤的是(

)例

2CA．需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ來切割質粒B．表達載體中的青霉素抗性基因在受體細胞中能復制C．任何基因表達載體中都必須要有青霉素抗性基因作為標記基因D．表達載體中目的基因的上游有啟動子和復制原點解析：限制酶SmaⅠ的識別序列位于目的基因上，因此表達載體構建時不能用限制酶SmaⅠ，應用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正確；表達載體中的青霉素抗性基因在受體細胞中能穩定存在且遺傳給下一代，B正確；基因表達載體中標記基因的種類很多，不一定都是青霉素抗性基因，C錯誤；表達載體中目的基因的上游有啟動子，是mRNA聚合酶識別和結合的位點，同時在目的基因的上游還有復制原點用于目的基因的復制，D正確。〔變式訓練〕2．下列有關基因工程中載體的說法，正確的是(

)A．在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒B．所有的質粒都可以作為基因工程中的載體C．質粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子D．作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因D解析：在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的，A錯誤；具有一至多個限制酶切點、具有標記基因的質粒才可以作為基因工程中的載體，B錯誤；質粒是一種獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環狀DNA分子，C錯誤；作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因，而且能在受體細胞中復制并穩定保存，D正確。考點二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞______或獲得預期____________等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關的已知_____________________的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用_______________和序列比對工具進行篩選。性狀表達產物結構和功能清晰序列數據庫(3)目的基因的獲取①人工合成____________。②常用_________特異性地快速擴增目的基因。2．基因表達載體的構建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因____________________________________________，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。目的基因PCR在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代(2)基因表達載體的組成及作用(3)構建過程3．將目的基因導入受體細胞生物種類植物動物微生物常用方法農桿菌轉化法、_________________顯微注射法______處理法受體細胞__________________________原核細胞轉化過程將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態→基因表達載體導入花粉管通道法Ca2＋體細胞或受精卵受精卵辨析(1)轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持_______________的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是____________。(2)農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入，第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的_______________上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的__________________上；第一次導入是將含目的基因的Ti質粒導入_________，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入____________。穩定和表達基因重組染色體DNAT－DNA農桿菌受體細胞(3)農桿菌特點①能在自然條件下侵染_______________和____________，而對大多數_______________沒有侵染能力。②農桿菌細胞內含有____________，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T－DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。雙子葉植物裸子植物單子葉植物Ti質粒4．目的基因的檢測與鑒定易錯整合，判斷正誤。(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。(

)(2)構建基因表達載體是轉基因工程的核心工作。(

)(3)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部分，有了它才能驅動DNA的復制過程。(

)(4)轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。(

)

√

√

√

×1．PCR可以擴增mRNA嗎？提示：不可以，因為PCR是用DNA雙鏈作模板的，不能直接用單鏈RNA作PCR的模板，必須把mRNA逆轉錄成單鏈cDNA之后再做PCR。2．為什么不能將目的基因插入載體的標記基因中？提示：標記基因用于鑒定目的基因是否成功導入受體細胞，以便將含目的基因的細胞篩選出來，若標記基因中有目的基因插入，則標記基因被破壞，無法進行篩選。3．新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的檢測原理是什么？提示：通過提取病人樣本中的RNA，進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR)，通過擴增反應將樣本中微量的病毒信息進行放大，最后以熒光的方式讀取信號。如果PCR之后信號為陽性，那么就可以認為樣本中存在病毒(已經感染)，反之表明樣本中沒有病毒(未感染)。1．PCR技術和DNA復制的比較歸納總結：(1)在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。(2)引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段。(3)真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。(4)PCR擴增過程中的循環圖示與規律循環次數123nDNA分子數2482n含引物A(或B)的DNA分子數1372n－1同時含引物A、B的DNA分子數0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物數量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－22.如何篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。(2)被轉化的大腸桿菌有三種：含環狀目的基因的大腸桿菌、含重組質粒的大腸桿菌、含質粒的大腸桿菌。(3)篩選方法：將大腸桿菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的大腸桿菌和含質粒的大腸桿菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。3．啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA使轉錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)考向

目的基因的獲取(2022·山東六校學情聯考)通過設計引物，運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2的5′端分別設計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關敘述錯誤的是(

)例

3AA．在PCR體系中還需要加入4種游離脫氧核苷酸、解旋酶、耐高溫的DNA聚合酶等B．第3輪PCR中，引物1能與圖中的②結合并且形成突變基因C．引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入基因表達載體D．在第3輪PCR結束后，含突變堿基對的DNA占1/4解析：在PCR體系中還需要加入4種游離脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等，但不需要加入解旋酶，A錯誤；②是引物2以引物1擴增得到的DNA鏈為模板進行復制得到的，故在第3輪PCR中，引物1能與圖中的②結合并且形成含兩條鏈的突變基因，B正確；引物中設計兩種限制酶識別位點，可以配合載體的限制酶識別位點，幫助目的基因定向定點插入基因表達載體，避免發生自身環化，C正確；在第3輪PCR結束后，含突變堿基對的DNA有2個，總DNA分子共8個，所以其比例為1/4，D正確。〔變式訓練〕3．圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題：(1)EcoRV酶切位點為

，EcoRV酶切出來的線性載體P1為___末端。(2)用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為_____________________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_______________酶作用下，形成重組質粒P3。平胸腺嘧啶(T)DNA連接(3)為篩選出含有重組質粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據表中結果判斷，應選擇的菌落是___(填表中字母)類，另外兩類菌落質粒導入情況分別是____________________、_________________________。BA類菌落含有P0C類菌落未轉入質粒

菌落類型平板類型ABC無抗生素＋＋＋氨芐青霉素＋＋－四環素＋－－氨芐青霉素＋四環素＋－－(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是_________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段，原因是________________________。乙、丙目的基因反向連接解析：(1)從圖中可以看出，EcoRⅤ酶切出來的載體質粒為平末端。(2)從圖中可以看出，目的基因的兩端各有一個游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應該各添加一個胸腺嘧啶脫氧核苷酸，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來。(3)由題意可知，構建重組質粒時四環素抗性基因被破壞，所以導入目的基因的菌落只能在沒有抗生素或含有氨芐青霉素的培養基中存活，應該選B類菌落。A類菌落能在表中條件下存活，說明導入的是P0質粒。C類菌落只能在無抗生素的培養基中存活，說明C類菌落沒有導入質粒。(4)據圖分析，目的基因的外側鏈只能用丙作引物，內側鏈可用甲、乙作引物，若選用另一對甲、乙作引物，會出現目的基因反接擴增出的DNA片段為400bp，則正好是目的基因反向連接后，外側鏈用乙作引物，內側鏈用甲作引物擴增出的片段。考向

基因工程的操作程序(2022·山東高三聯考)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面，構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述，正確的是(

)例4DA．過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB．重組基因表達載體上的啟動子需來源于戊型肝炎病毒C．過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態D．過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定解析：戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A項錯誤；啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別結合以驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異表達pORF2蛋白的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種和組織細胞的啟動子，B項錯誤；將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，C項錯誤。〔變式訓練〕4．(2022·山東德州質檢)研究人員將GNA基因和ACA基因連接成融合基因，再與pBⅠ121質粒載體結合，導入玉米細胞，最終獲得了抗蚜蟲玉米新品種，部分操作如圖，下列相關敘述錯誤的是(

)注：圖中KpnⅠ、BsaBⅠ、XhoⅠ為限制酶DA．①②過程均需使用DNA連接酶，②過程是基因工程的核心步驟B．與只用KpnⅠ相比，用KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確C．檢測出玉米細胞中含有融合基因，也不能說明抗蚜蟲玉米培育成功D．在加入卡那霉素的培養基上存活下來的細胞，一定是成功導入重組載體的細胞解析：導入含有卡那霉素抗性基因的非重組載體的玉米細胞也能在加入卡那霉素的培養基上存活下來，D錯誤。考點三基因工程的應用和蛋白質工程1．基因工程在農牧業方面的應用2．基因工程在醫藥衛生領域的應用3．基因工程在食品工業方面的應用4．蛋白質工程概念基礎蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系手段改造或合成基因目的根據人們對蛋白質功能的特定需求，對蛋白質的結構進行設計改造或制造新的蛋白質流程預期蛋白質功能→設計預期的_______________→推測應有的_____________→找到并改變相對應的______________________或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質蛋白質結構氨基酸序列脫氧核苷酸序列(基因)應用①臨床上：研發出速效__________________產品②醫藥工業方面：改變干擾素分子上的一個半胱氨酸，以延長干擾素的保存時間等③其他工業方面：改進___的性能或開發新的工業用酶④農業方面：改造某些參與調控光合作用的酶，以提高植物光合作用效率，增加糧食產量等胰島素類似物酶易錯整合，判斷正誤。(1)干擾素是一種具有干擾病毒復制作用的糖蛋白，在臨床上被廣泛應用。(

)(2)基因工程中可以將目的基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調控元件重組在一起，得到乳腺生物反應器。(

)(3)蛋白質工程的目的是改造或合成人類需要的蛋白質。(

)(4)蛋白質工程在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變其分子的結構。(

)√

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×1．蛋白質工程為什么通過對基因操作來實現對天然蛋白質的改造？提示：①蛋白質具有十分復雜的空間結構，基因的結構相對簡單，容易改造。②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質無法遺傳。2．基因工程能否完全滿足人們生產和生活的需要，為什么？提示：不能，因為基因工程原則上只能生產自然界中已存在的蛋白質，這些蛋白質不能完全滿足人類的需要。1．乳腺生物反應器與工程菌的比較比較內容乳腺生物反應器工程菌含義讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的微生物基因表達合成的藥物蛋白與天然蛋白相同細菌合成的藥物蛋白可能沒有活性受體細胞動物受精卵微生物細胞目的基因導入方式顯微注射法Ca2＋處理法生產條件不需要嚴格滅菌，溫度等外界條件對其影響不大需要嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養物質濃度等外界條件藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細胞或其培養液中提取2.蛋白質工程與基因工程的異同項目蛋白質工程基因工程過程從預期的蛋白質功能出發→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質目的基因的篩選與獲取→基因表達載體的構建→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定項目蛋白質工程基因工程實質定向改造或生產人類所需要的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品結果可生產自然界中不存在的蛋白質只能生產自然界中已存在的蛋白質聯系蛋白質工程是在基因工程的基礎上，延伸出來的第二代基因工程考向

基因工程的應用

某些膀胱上皮細胞可以產生一種稱為尿血小板溶素的膜蛋白。科學家將人的生長激素基因插入小鼠基因組內制成膀胱生物反應器，使小鼠膀胱可以合成人的生長激素并分泌到尿液中。下列說法正確的是(

)A．利用膀胱生物反應器生產人的生長激素屬于蛋白質工程的應用B．需要將尿血小板溶素基因與生長激素基因的啟動子重組在一起C．轉基因小鼠中，人的生長激素基因只存在于膀胱上皮細胞中D．只在小鼠細胞中檢測到人的生長激素基因，不能說明該技術已獲得成功例

5D解析：利用膀胱生物反應器生產人的生長激素，屬于基因工程的應用，A錯誤；在研制膀胱生物反應器時，應使外源基因在小鼠的膀胱上皮細胞中特異表達，故應將生長激素基因(目的基因)與膀胱中特異表達的基因的啟動子等調控元件重組在一起，B錯誤；成功導入的人生長激素基因存在于小鼠的所有細胞中，但只在膀胱組織細胞中才表達，C錯誤；只在小鼠細胞中檢測到人的生長激素基因，不能說明該技術已獲得成功，若證明該技術成功，則需要檢測到成功表達的人生長激素，可通過抗原－抗體雜交技術進行檢測，D正確。〔變式訓練〕5．免疫缺陷癥患者因缺失ada基因而患該病，實驗人員利用基因療法將人正常的ada基因轉入該病患者的T細胞中，可改善患者的免疫功能，具體過程如圖所示。下列說法正確的是(

)A．ada基因是從人體細胞中直接分離出來的B．各種遺傳病都可以通過基因治療治愈C．基因治療的實質是對有缺陷的細胞進行基因修復D．病毒的作用是作為攜帶ada基因的載體D考向

蛋白質工程及其應用

胰島素可用于治療糖尿病，但胰島素注射后易在皮下堆積，需較長時間才能進入血液，進入血液后又易被分解，因此治療效果受到影響。下圖是新的速效胰島素的生產過程，有關敘述錯誤的是(

)例

6BA．新的胰島素的預期功能是構建新胰島素模型的主要依據B．新的胰島素生產過程中不涉及中心法則C．若用大腸桿菌生產新的胰島素，常用Ca2＋處理大腸桿菌D．新的胰島素功能的發揮必須依賴于蛋白質正確的高級結構解析：新的胰島素的預期功能是構建新胰島素模型的主要依據，A項正確；新的胰島素生產過程中，涉及轉錄、翻譯等過程，B項錯誤；Ca2＋處理大腸桿菌，可將目的基因導入大腸桿菌生產新的胰島素，C項正確；根據結構與功能相適應的原理分析，新的胰島素功能的發揮必須依賴于蛋白質正確的高級結構，D項正確。〔變式訓練〕6．已知生物體內有一種轉運蛋白Y，由300個氨基酸組成。如果將Y中157位的L異亮氨酸變成亮氨酸，261位的酪氨酸變成絲氨酸，改變后的蛋白質Y1不但保留了原有Y的功能，且具備了催化活性。下列說法正確的是(

)A．蛋白質工程和基因工程的根本區別是操作對象的差異B．可以通過對Y蛋白基因進行修飾或人工合成獲得Y1蛋白基因C．蛋白質工程操作過程中，不需要酶和載體作為工具D．細胞內合成Y1蛋白與Y蛋白的過程中，遺傳信息的流向是相反的B解析：蛋白質工程和基因工程的根本區別是蛋白質工程可產生自然界中沒有的蛋白質，A錯誤；據分析和題干信息可知，可以通過對Y蛋白基因進行修飾或人工合成獲得Y1蛋白基因，B正確；蛋白質工程操作過程中，需要酶和載體作為工具，C錯誤；細胞內合成Y1蛋白與Y蛋白的過程中，遺傳信息的流向是相同的，D錯誤。1．(2021·遼寧卷)腈水合酶(N0)廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域，但不耐高溫。利用蛋白質工程技術在N0的α和β亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型腈水合酶(N1)。下列有關敘述錯誤的是(

)A．N1與N0氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一B．加入連接肽需要通過改造基因實現C．獲得N1的過程需要進行轉錄和翻譯D．檢測N1的活性時先將N1與底物充分混合，再置于高溫環境D解析：酶具有高效性，檢測N1的活性需先將其置于高溫環境，再與底物充分混合，D錯誤。2．(2021·遼寧卷)PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因)，大小為0.9kb(1kb＝1000堿基對)，利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：(1)為獲取phb2基因，提取該動物肝臟組織的總RNA，再經_________過程得到cDNA，將其作為PCR的模板，并設計一對特異性引物來擴增目的基因。逆轉錄(2)圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見下表。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入_________和_________兩種不同限制酶的識別序列。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用________________________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。EcoRⅠPstⅡT4DNA連接酶相關限制酶的識別序列及切割位點注：箭頭表示切割位點名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPstⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠCTGC↓AGGA↑CGTCKpnⅠG↓GTACCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑G(3)轉化前需用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于_________的生理狀態，以提高轉化效率。(4)將轉化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養基上進行培養，隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養并提取質粒，用(2)中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如圖2，___號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。感受態3注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現在圖中解析：(1)利用RNA獲得cDNA的過程稱為逆轉錄。(2)根據啟動子和終止子的作用可知，目的基因應導入啟動子和終止子之間，從圖中看出，兩者之間存在三種限制酶切點，但是由于KpnⅠ在質粒上不止一個酶切位點，所以應該選擇EcoRⅠ和PstⅡ兩種不同限制酶；根據PstⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以構建基因表達載體時，應該用T4DNA連接酶連接質粒和目的基因。(3)轉化時用CaCl2處理大腸桿菌細胞，使其處于感受態的生理狀態，以提高轉化效率。(4)由于這些菌落都可以生長在含有氨芐青霉素的培養基中，因此都含有質粒，重組質粒包含了目的基因和質粒，如果用EcoRⅠ和PstⅡ兩種酶切割重組質粒，電泳后將獲得含有質粒和目的基因兩條條帶，由于phb2基因大小為0.9kb，所以對應電泳圖中的菌落3。3．(2021·山東卷)人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有

BCL11A

蛋白結合位點，該位點結合

BCL11A

蛋白后，γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對γ基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療。科研人員擴增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測，以確定

BCL11A

蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達，需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是_________，在R末端添加的序列所對應的限制酶是_________。本實驗中，從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要___種酶。SalⅠEcoRⅠ6(2)將構建的載體導入除去

BCL11A

基因的受體細胞，成功轉化后，含F1～F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是__________________________________________________。F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(3)向培養液中添加適量的雌激素，含F1～F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，而含F5～F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有

BCL11A

蛋白的結合位點序列，據此結果可推測，BCL11A

蛋白結合位點位于_____________________________________________________，理由是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上情況判斷，F1～F4與R擴增產物上均有結合位點，因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游(右側)；F5～F6與R擴增產物上均無結合位點，可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游(左側)，所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上根據有無熒光解析：(1)據題意可知，需要將擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達，則含有啟動子P的擴增后的產物讀取方向與熒光蛋白基因的讀取方向一致，故擴增后的產物中的R端與熒光蛋白基因中限制酶MunⅠ識別序列端結合，才能保證擴增后的產物定向插入并指導熒光蛋白基因的表達。要做到定向插入，需要引物末端兩端添加限制酶的識別序列，且被限制酶識別并切割后，兩端的黏性末端不能相同。而擴增后的產物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的識別位點，故在引物末端添加限制酶的識別序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所識別，故應該選用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ識別序列，據圖中對限制酶的注釋可知，限制酶MunⅠ識別并切割后的黏性末端與限制酶EcoRⅠ識別并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ；熒光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的識別位點，故對載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。綜上所述，對載體使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，對擴增后的產物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA連接酶的催化作用下，連接形成重組載體；產物擴增中需要使用Taq酶催化，合成更多的產物，故從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要6種酶，分別是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA連接酶。(2)受體細胞中已經除去BCL11A基因，故擴增產物中的BCL11A蛋白結合位點不會抑制熒光蛋白基因的表達；基因的表達需要RNA聚合酶與啟動子結合，才能完成熒光蛋白基因的轉錄過程；含F1～F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光，含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光，則可能是F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達。(3)向培養液中添加適量的雌激素，此時重組載體上的BCL11A基因表達，產生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結合位點結合后，導致熒光蛋白基因被抑制；含F1～F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光，則說明BCL11A蛋白與結合位點在引物F4與引物R之間的序列上；含F5～F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光，則說明BCL11A蛋白結合位點在引物F5的上游序列，故據此結果可推測，BCL11A蛋白結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上。4．(2022·湖南卷)水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性。回答下列問題：(1)蛋白質工程流程如圖所示，物質a是_______________________，物質b是____________。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是_____________________。氨基酸序列多肽鏈mRNA密碼子的簡并性(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有____________________________________、__________________________________________和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是_____________________。從基因文庫中獲取目的基因通過DNA合成儀用

化學方法直接人工合成DNA雙鏈復制(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的______(填“種類”或“含量”)有關，導致其活性不同的原因是__________________________________________________________________________________________。種類提取的水蛭蛋白的酶解時間和處理的酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間

取3支試管，解析：(1)據分析可知，物質a是氨基酸序列多肽鏈，物質b是mRNA。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是密碼子的簡并性，即一種氨基酸可能有幾個密碼子。(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是DNA雙鏈復制。(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，據圖可知，水解產物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而水解產物中抗凝血活性有差異，經酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩定，經酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產物的抗凝血活性最終高于經酶乙處理后的酶解產物的抗凝血活性，差異明顯，據此推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的種類有關，導致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解時間和酶的種類不同，導致水蛭蛋白空間結構有不同程度破壞。(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，實驗設計思路為：取3支試管，分別加入等量的蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一種動物(如家兔)血液，立即將等量的血液加入1、2、3號三支試管中，靜置相同時間，統計三支試管中血液凝固時間。5．(2022·山東卷)某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影