煙草灰霉病內(nèi)生生防菌的分離鑒定

近年來，云南、湖南和廣西等地[1.3]稻草菌病呈惡化趨勢。目前防治灰霉病主要依賴化學(xué)藥劑,而化學(xué)藥劑容易造成病菌產(chǎn)生耐藥性、環(huán)境污染等問題。研究人員通過大量試驗發(fā)現(xiàn),一些有益微生物、微生物代謝物對灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用,生物防治作為控制灰霉病逐漸被重視[4~6]。本研究的前期工作獲得一批煙草內(nèi)生細(xì)菌菌株,其中Y11和Y141對煙草灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用。本研究對這兩株菌株進(jìn)行鑒定,以明確其分類地位,并初步探討其生防機(jī)制,為抗病復(fù)合微生物的組合以及田間應(yīng)用提供依據(jù)。1材料和方法1.1基、營養(yǎng)肉汁水培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉汁瓊脂(NutrientAgar,NA)培養(yǎng)基的配制參照方中達(dá)的方法。供試煙草內(nèi)生細(xì)菌菌株Y11和Y141、對照菌株B47和Tbs-1、煙草灰霉病菌及抑菌譜測試中的植物病原真菌均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)研究室提供。1.2方法1.2.1形狀、形狀將稀釋的生防菌株懸浮液涂布均勻于NA平板上,28℃恒溫培養(yǎng),出現(xiàn)單菌落后,觀察其形狀、大小、顏色、邊緣、表面、隆起形狀、透明度等;菌株在NA斜面培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)12h用于電子顯微鏡觀察;生理生化反應(yīng)測試參照東秀珠等介紹的方法進(jìn)行,對照菌株為枯草芽孢桿菌B47(B.subtilis)和丁香假單胞菌Tbs-1(P.syringae)。1.2.2細(xì)菌gyrb基因檢測引物篩選蛋白酶裂解法制備細(xì)菌DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用常規(guī)的細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增通用引物、細(xì)菌gyrB基因擴(kuò)增通用引物和測序引物。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,隨后將測定的堿基序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較,并用軟件MEGA5構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3平板制備將生防菌株移入NA培養(yǎng)液中,28℃120r/min培養(yǎng)5d,將發(fā)酵液4℃下5000r/min離心50min,取上清液,用直徑為0.22μm細(xì)菌過濾器過濾,稀釋成1、10、100、1000倍液,分別與45℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻制成平板。每一濃度重復(fù)3次,無菌培養(yǎng)液為對照。將直徑為7mm的煙草灰霉病菌菌餅移至培養(yǎng)皿中央,23℃培養(yǎng)3d后測量生長菌落直徑,計算相對抑制率。1.2.4相對抑制率測定在PDA平板中央接種煙草灰霉病菌菌餅(直徑7mm),在另一個同樣大小的NA平板上均勻涂布生防菌,將前者反扣于后者之上,兩皿接觸處用封口膜密封,以未涂布生防菌的NA平板作對照,于23℃下培養(yǎng)3d后測量菌落直徑,按1.2.3的方法計算相對抑制率。每處理重復(fù)3次。1.2.5煙草灰霉病菌菌餅形態(tài)觀察在無菌培養(yǎng)皿中加入適量的PD培養(yǎng)液,接入一塊直徑為7mm的煙草灰霉病菌菌餅,23℃培養(yǎng)48h,將病菌菌絲體轉(zhuǎn)移至生防菌的無菌濾液處理24h后,以無菌培養(yǎng)液處理為對照,挑取少量菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。1.2.6相對抑制率測定按照1.2.3中的方法,將振蕩培養(yǎng)48h的生防菌液離心并過濾,獲得無菌濾液,與PDA培養(yǎng)基(1∶9)混勻制成PDA平板。從植物病原菌菌落邊緣打取直徑為7mm的菌餅,移至平板中央,28℃培養(yǎng),以無菌培養(yǎng)液為對照。待對照中的菌落基本長滿培養(yǎng)皿時,測量各菌落直徑,按1.2.3的方法計算相對抑制率。每處理重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1抗生細(xì)菌的鑒定2.1.1芽孢桿菌群落型菌株Y11的菌落乳白色,不規(guī)則橢圓形,中央凸起,表面干燥、不透明,邊緣整齊,具有一定粘稠性,不易挑起;電子顯微鏡下的菌體均為短桿狀,周生鞭毛,菌體大小為(1.0~1.2)μm×(3.1~3.5)μm。革蘭氏染色陽性,好氧型,氧化分解葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,氧化酶陰性,接觸酶陽性,甲基紅反應(yīng)陰性(或陽性),不產(chǎn)生(或產(chǎn)生)H2S,V-P反應(yīng)陽性,不產(chǎn)生吲哚,還原硝酸鹽,可水解明膠和淀粉,能利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽。結(jié)合菌落性狀及菌體形態(tài),可以確定Y11屬于芽孢桿菌類群。菌株Y141菌落淡黃色,圓形,中央隆起,表面光亮,邊緣整齊;電子顯微鏡下的菌體桿狀,極生鞭毛,大小為(0.7~0.8)μm×(2.1~2.4)μm。革蘭氏染色陰性,好氧非發(fā)酵型,氧化分解葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,氧化酶和接觸酶陽性,甲基紅和V-P反應(yīng)陰性,不產(chǎn)生吲哚,不產(chǎn)生H2S,還原硝酸鹽,不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶,可產(chǎn)生精氨酸雙水解酶,可水解明膠,不可水解淀粉,能夠利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽,在金氏B培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃綠色熒光色素,不產(chǎn)生膿青素。結(jié)合菌落性狀及菌體形態(tài),基本確定Y141屬于產(chǎn)熒光假單胞菌類群。2.1.2菌株與假單胞菌的同源性分析結(jié)果①生防菌16SrDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。經(jīng)測序,生防菌株Y11和Y141的16SrDNA擴(kuò)增序列片斷長度各為1453和1462bp。通過BLAST分析,菌株Y11的16SrDNA序列與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens的同源性最高,為99%。以Xanthomonasaxonopodis為外群構(gòu)建菌株Y11和另外2株本研究室分離所得菌株G59,G81與Genbank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)18株細(xì)菌的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),3株生防菌以81%的支持率與解淀粉芽孢桿菌同處在一個較小的分支內(nèi),說明Y11與解淀粉芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。將菌株Y141的16SrDNA序列進(jìn)行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)其與假單胞屬中的多個菌株最高有98%的同源性,這些菌株包括一些未定種、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、韓國假單胞菌(P.koreensis)、惡臭假單胞菌(P.putida)等。以Brevibacillusbrevis為外群構(gòu)建的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,菌株Y141和另外1株本研究室分離得菌株Y88與熒光假單胞菌以68%的支持率處在一個分枝內(nèi),而三者又以98%的支持率與另兩株熒光假單胞菌處在一個分枝內(nèi)(圖2),說明菌株Y141與熒光假單胞菌的親緣關(guān)系最近。②生防菌gyrB基因序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。經(jīng)測序,生防菌株Y11和Y141的gyrB基因擴(kuò)增序列片斷長度各為1215和1144bp。BLAST分析結(jié)果顯示,菌株Y11與解淀粉芽孢桿菌的同源性最高,為99%。以Enterobactercloacae為外群構(gòu)建的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹中,G59、G81、Y11以97%的支持率聚在一個較小的分枝內(nèi),而同時3株生防菌又與兩株解淀粉芽孢桿菌以99%的支持率聚在一個分支內(nèi)(圖3),說明菌株Y11與解淀粉芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。菌株Y11的gyrB基因序列分析結(jié)果與其16SrDNA序列分析結(jié)果一致,結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性等表型鑒定結(jié)果,將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌BLAST結(jié)果表明,菌株Y141與網(wǎng)上登錄的假單胞屬中的菌株最高有95%的同源性,同源性達(dá)到90%以上的菌株主要包括一些未定種、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、惡臭假單胞菌(P.putida)、油菜假單胞菌(P.brassicacearum)等,其中與熒光假單胞菌的同源性從88%至95%不等。以X.albilineans為外群構(gòu)建的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹中,菌株Y88和Y141以99%的支持率聚在一個小分支內(nèi),而同時它們又以99%的支持率與兩株熒光假單胞。菌聚在一個分枝內(nèi)(圖4),說明菌株Y141與假單胞菌屬的熒光假單胞菌的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性等表型鑒定結(jié)果,初步將菌株Y141鑒定為熒光假單胞菌。2.2生預(yù)防菌對草灰霉病菌的生防機(jī)制2.2.1胞外代謝產(chǎn)物對病原菌生長和分子消毒的影響:胞外代謝產(chǎn)物對病原菌生長的影響圖5顯示,菌株Y11和Y141不同濃度的胞外代謝產(chǎn)物均能在一定程度上抑制灰霉病菌菌絲的生長,但隨著濃度降低,對病菌菌絲的抑制率也下降。菌株Y11的胞外代謝產(chǎn)物對病菌菌絲的抑制率更強(qiáng),原液的抑制率超過90%。另外,Y11和Y141產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病菌菌絲生長也有一定的抑制作用,但抑制率較低,分別為31.04%和43.87%。2.2.2分布均勻，分布均勻正常條件下生長的煙草灰霉病菌菌絲體分支較多,細(xì)胞壁光滑飽滿,原生質(zhì)分布均勻。經(jīng)菌株Y11和Y141的胞外代謝產(chǎn)物處理后,菌絲形態(tài)均發(fā)生顯著變化,菌絲變粗,彎曲畸形,分支變少,菌絲頂端變短,延伸生長受阻,原生質(zhì)分布不均勻,有些部位滲漏變空,細(xì)胞壁變厚,有褶皺。2.3植物病原菌真菌的抑菌作用表1顯示,菌株Y11和Y141的胞外代謝產(chǎn)物對供試的12種植物病原真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用,其中對甘薯軟腐病菌和稻紋枯病菌的抑制率均較高,超過60%。3srrna的測序結(jié)果研究者們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的16SrDNA序列和gyrB基因等在其進(jìn)化過程中具有較高的保守性,但16SrD-NA平均堿基替換率為每5000萬年變化1%,而比gyrB基因的每100萬年變化0.7%~0.8%的速度慢。gyrB基因是編碼DNA促旋酶B亞基的基因,它彌補(bǔ)了非蛋白編碼基因16SrDNA序列無法區(qū)分近緣種的缺陷,比16SrDNA基因更好地區(qū)分近似種。但相比16SrDNA序列,一些細(xì)菌的gyrB基因信息相對較少,導(dǎo)致利用NCBI上的gyrB基因信息鑒定這些細(xì)菌尚存在一定困難。雖然采用分子鑒定方法能夠彌補(bǔ)細(xì)菌傳統(tǒng)鑒定方法的不足,但不同種屬細(xì)菌分子鑒定靶基因有所不同,選擇不恰當(dāng)?shù)陌谢蜻M(jìn)行鑒定也有可能獲得不準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究中,16SrDNA基因序列分析表明菌株Y141與多株熒光假單胞菌同源性達(dá)到98%,但在gyrB基因分析中,同源性最高只有95%,甚至低于90%。gyrB基因序列對于假單胞菌屬細(xì)菌的種間分類意義值得研究人員進(jìn)一步探討。目前報道的煙草灰霉病菌的拮抗菌有膠凍樣芽孢桿菌(B.mucilaginosus)、共甲基營養(yǎng)型芽