第五章

基因文庫的構建與目的基因的克隆第一節基因文庫的構建GeneticEngineering一、什么是基因文庫基因文庫（genelibrary）：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因可以存在于長期保存的穩定的重組體中,需要時能夠隨時應用它分離目的基因.這種保存基因組遺傳信息的材料稱為基因文庫（人工構建）。建立基因文庫的目的:

便于目的基因的保存、擴增和純化；是分離克隆目的基因的主要途徑；是復雜基因組作圖的重要依據。根據基因類型，基因文庫分為：基因組文庫(含有全部基因)cDNA文庫(含有全部蛋白質編碼的結構基因)基因組文庫：將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中，所有的抗性克隆組成了DNA片段的集合體，稱為基因組文庫。cDNA文庫：某生物某一發育時期所轉錄的mRNA全部經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。GeneticEngineering二、基因文庫構建的基本戰略:用鳥槍法構建基因組文庫,材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫,材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等.顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫GeneticEngineering①重組克隆的總數不宜過大，以減輕篩選工作的壓力②載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆③克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區域，以利克隆排序④克隆片段易于從載體分子上完整卸下⑤重組克隆能穩定保存、擴增、篩選理想的基因文庫應具備下列條件：GeneticEngineering三、

基因組文庫構建將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中，所有的抗性克隆組成了DNA片段的集合體，稱為基因組文庫。1.構建基因組文庫的載體②目前常用的載體載體容量越大，所要求的DNA片斷數目越少。①對載體的要求

載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kbGeneticEngineering斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備2.基因組文庫構建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。①物理切割法：內切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb的隨機片斷。②酶切法：GeneticEngineering（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內切酶粘性末端片斷。GeneticEngineering各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶粘性末端③同聚物加尾GeneticEngineeringGeneticEngineering3.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含整個基因組DNA的概率（99%）f:克隆片段的平均大小/生物基因組的大小N：基因組文庫最低所含克隆數GeneticEngineering例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1054.61×GeneticEngineering二、cDNA文庫的構建1.cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物將某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，克隆到細菌細胞中，稱cDNA文庫。GeneticEngineering（1）不含內含子序列（2）可以在細菌中直接表達（3）包含了所有編碼蛋白質的基因（4）比DNA文庫小的多，容易構建3.cDNA文庫的特點4.構建cDNA文庫的載體絕大多數真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質粒.GeneticEngineering5.構建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取提取總RNA有商業化的試劑盒（kit）或者自己配制相關的試劑。利用mRNA含有的一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%（2）mRNA的分離純化①原理GeneticEngineering采用用商業化的OligodT纖維柱②mRNA的分離純化Column（柱）當總RNA通過已用oligo(dT)處理過的纖維素柱時，mRNA分子的poly(A)尾巴便會同oligo(dT)序列雜交而黏附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。GeneticEngineeringGeneticEngineering反轉錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉錄酶能以mRNA為模板合成cDNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物GeneticEngineering用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH堿GeneticEngineering剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成GeneticEngineering④去掉發卡結構核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’GeneticEngineeringGeneticEngineering這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA連接酶將岡崎片斷連成一整條DNA鏈mRNAcDNA3’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligaseGeneticEngineering在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。或借助末端轉移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。（4）cDNA與載體連接接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶GeneticEngineering（5）導入受體細胞GeneticEngineering6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：文庫最低所含克隆數1n1n第二節目的基因的克隆GeneticEngineering“克隆”（clone）

個體水平上，表示由具有相同基因型的同一物種的兩個個體或數個個體組成的群體；細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體；分子水平上，凡帶有一段DNA插入序列的、獨特的寄主/載體單元亦叫做克隆。外源基因與目的基因：把插入到載體內的哪個特定的片段基因稱為“外源基因”。將那些已被分離或者準備要被分離、改造擴增或表達的特定基因DNA片段稱為“目的基因”。“鳥槍法”的概念直接從生物細胞基因組中獲取目的基因最常用的方法是“鳥槍法”，又稱為“散彈槍法”。是將基因組按染色體分開后，將其全部打亂，切成碎片，進行隨機測定每個小片段序列，測序后利用計算機對這些切片進行排序和組裝，并確定它們在基因組中的正確位置。一、鳥槍法克隆目的基因GeneticEngineering一、鳥槍法克隆目的基因基本戰略：將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的DNA片段，分別連接到載體DNA上，轉化受體細胞，形成一套重組克隆，從中篩選出含有目的基因的期望重組子。GeneticEngineering操作程序（1）目的基因組DNA片段的制備超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控。部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。GeneticEngineering（2）與載體連接一般選擇質粒或λ-DNA作為克隆載體（3）轉化受體細胞多采用大