溫陽益氣法治療變應性鼻炎病證復合模型的建立及藥效學研究

變應性鼻炎（ar）是一種由易感個體接觸引起的過敏轉化為包含ige指南的炎癥介質（主要是組胺）的炎癥性疾病，以各種免疫活性細胞和細胞因子參與的鼻粘膜慢性炎癥疾病。主要臨床表現有鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏以及嗅覺功能障礙等。祖國醫學認為本病病位在肺,與脾腎有關。許多現代研究表明,變應性鼻炎脾氣虛證較多見。本實驗采用制作脾氣虛模型和脾氣虛AR證病復合模型的方法,試圖為探討脾虛與變應性鼻炎的相關性提供實驗資料,現將結果報道如下。1材料表面1.1實驗動物及分組健康SD大鼠50只,體質量200～220g,雌雄各半,由南京中醫藥大學實驗動物中心提供,隨機分為5組,即:空白組;脾氣虛模型組;AR組;脾氣虛+AR組;脾氣虛+AR+中藥組,每組10只。1.2儀器和試劑1.2.1試劑與儀器實驗用卵白蛋白(美國SIGMA公司生產);伊文思蘭(中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司);氫氧化鋁粉末(上海美興化工有限公司);嗜酸性粒細胞直接計數液,南京建成生物工程研究所;大鼠IL-5、ECP試劑盒(美國RD公司生產,上海韻涵生物科技公司分裝)。1.2.2儀器、試劑和儀器高速臺式離心機,南京大學南達生物技術開發公司;電子天平(FA2004)上海良平儀器儀表有限公司;顯微鏡(OlympusAX80型日本);隔水式恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;自動酶標讀數儀ELX-800美國BIOTEK生產;數顯恒溫水浴鍋,南京大學普陽科學儀器研究所。1.2.3中藥風味處理實驗所用中藥材由南京中醫藥大學附屬醫院中藥房提供。1濃縮生藥溶液取生大黃按1∶5比例加水,浸泡24h,文火煎15min,自然冷卻,4層紗布過濾,于80℃的恒溫水浴里濃縮成相當于生藥1g/mL濃度的溶液,放入4℃冰箱冷藏備用。2龍甘草的制備由黃芪、黨參、白術、防風、陳皮、烏梅、地龍、甘草等組成,所需藥材加水浸泡1h,煮沸2次,每次1h,過濾后并濃縮濾液,每mL含生藥1.5g,放冰箱冷藏備用。2方法和結果2.1模型方法2.1.1注射成功率及持續時間按文獻的方法AR組實驗組動物以卵白蛋白0.3mg作抗原,氫氧化鋁粉末30mg作佐劑,加生理鹽水1mL形成混懸液,腹腔內注射,隔日1次,共7次。腹腔注射完成后的第2天,行被動皮膚免疫反應(passive-cutaneous-anaphylaxis,PCA)試驗,確定OVIgE抗體效價升高后,每側鼻腔均以5%卵白蛋白溶液10μL局部免疫,每日1次,共7次。2.1.2大、大鼠的飲食參照文獻脾氣虛組采用大黃法、游泳力竭法、饑餓法等多因素復合傷脾的方法,即:①每日上午以3mL/只灌服大黃制劑液,日1次;②每日下午于大鼠尾根部纏繞質量為該大鼠體質量10%的保險絲,放入水深50cm、水溫20℃的水槽中游泳,以力竭為度——大鼠鼻尖沒入水面10s,每日1次;③控制飲食,每日上午8:00給食,下午8:00撤食。共21d。2.1.3復合模型脾氣虛AR組先造成脾氣虛模型,再造AR病證復合模型,造模方法同AR組實驗動物。2.1.4溫陽犯罪日對大鼠脾氣虛及致敏造模方法同復合模型組,在鼻腔局部攻擊開始的第1天,用溫陽益氣方5.85g/kg灌胃,每日1次,共7d。空白組不作任何處理。2.2觀察指標2.2.1鼻部癥狀觀察和單次激發計算從造模第1天開始,觀察動物的一般狀態:包括攝食、飲水、大小便性狀、體質量、活動情況,著重鼻部癥狀觀察,鼻癢、噴嚏、鼻分泌物等情況。鼻部癥狀觀察:每次鼻腔激發后30min內,分別觀察動物搔鼻動作,噴嚏、流清涕等鼻部癥狀,各指標采用疊加量化記分法。鼻癢:抓鼻1～5次為1分,5次以上為2分;噴嚏:1～3個為1分,4～10個為2分,11個以上為3分;清涕:流至前鼻孔為1分,超出前鼻孔為2分,涕流滿面為3分。將每只大鼠7次激發得分的均數作為該大鼠的行為學計分。若計分>5分,則證明變應性鼻炎模型復制成功。2.2.2皮膚硬結和染料擴散正常組、脾氣虛組大鼠用0.1mL生理鹽水皮內注射,AR組、脾虛AR組及脾虛AR中藥組大鼠用含有1mg卵清蛋白和1%伊文斯蘭混合液0.1mL皮內注射,30min后觀察注射部位的皮膚硬結和染料擴散情祝,當直徑<5mm記為(-)、直徑在5～10mm之間記為(士)、直徑>10mm記為是(+)PCA反應。若PCA反應陽性證明大鼠體內有OVA特異抗體,表示造模(過敏模型)成功。2.2.3嗜酸性細胞檢測于末次鼻腔局部致敏后30min,將各組大鼠以10%水合氯醛注射液按3mg/kg腹腔注射麻醉,眼眶取血20μL加入0.38mL嗜酸性粒細胞直接計數液中混勻,滴入血球計數板低倍鏡下計數嗜酸性粒細胞,將大鼠處死,并將上頜骨從顱骨中游離出來,沿鼻中線剪開鼻腔,暴露鼻中隔及雙側鼻腔。用小棉簽取鼻中隔表面分泌物涂片,用瑞氏-姬姆薩染,共計數200個白細胞,計算嗜酸性粒細胞(EOS)的陽性率。血清IL-5、ECP檢測,采用ELISA法。具體操作方法嚴格按使用說明書進行,于酶標儀450nm處讀吸光度值,根據標準曲線計算血清中和IL-5、ECP含量。2.3統計方法數據用SPSS12.0統計軟件處理。計數資料采用卡方檢驗,計量資料采用單因素方差分析及非參數檢驗。2.4結果2.4.1藥組動物的變應性麻黃模型脾虛組、脾虛AR組及脾虛AR中藥組進行脾氣虛模型造模后,出現反應遲鈍、精神不振、毛發枯槁、稀疏易脫落、便溏、腹瀉、脫肛、喜扎堆等癥狀。AR組、脾虛AR組及脾虛AR中藥組動物在變應性鼻炎模型造模10min內,均不同程度地出現了抓鼻和噴嚏、流涕癥狀,脾虛AR組及脾虛AR中藥組積分比AR組高,表明這2組的癥狀比AR組更為嚴重。隨著給藥時間的延長,上述癥狀逐漸加重,而脾虛AR中藥組在局部致敏后第3天,鼻部癥狀積分與脾虛AR組相似,至第5天,脾虛AR中藥組癥狀積分比脾虛AR組低(P<0.05),到實驗結束時,其積分值明顯比脾虛AR組低,表明脾虛AR中藥組在用藥期間激發時癥狀(鼻癢、噴嚏、清涕)逐漸減輕,與脾虛AR組相比有統計學(P<0.05)意義(表1)。2.4.2各造資組致敏成功的結果見表1末次腹腔注射卵清蛋白后,對各組大鼠進行PCA試驗,結果見表2。結果表明各造模組致敏成功。實驗結束取材時,空白組與脾氣虛組血清接種的大鼠背部未見藍圈反應。說明AR組、脾虛AR組、脾虛AR中藥組AR模型造模成功。2.4.3各組中藥組和空白組8個月內7.表3結果表明,脾氣虛組、AR組、脾氣虛AR組與空白組相比,鼻腔分泌物中EOS百分率均有顯著升高(P<0.05,P<0.01);而脾氣虛AR中藥組與空白組比較,無顯著差異(P>0.05)。脾氣虛AR組與空白組、脾氣虛組、AR組、脾氣虛AR中藥組比較鼻腔分泌物中EOS百分率顯著升高(P<0.05,P<0.01)。血中EOS含量以脾氣虛AR組最高,AR組次之,與空白組相比有顯著差異(P<0.05),而脾氣虛AR中藥組與空白組比較,無顯著差異(P>0.05)。2.4.4兩組血清ecp含量比較表4結果顯示,AR組、脾氣虛AR組大鼠血清中IL-5含量與空白組相比有顯著性差異(P<0.01);脾氣虛、AR組、脾氣虛AR組血清中ECP含量與空白組相比顯著升高(P<0.05,P<0.01);脾氣虛AR中藥組與脾氣虛AR組相比,有顯著性差異(P<0.05,P<0.01);而與空白組比較,無顯著差異(P>0.05),提示,溫陽益氣方能調節血清中的IL-5、ECP含量。3對大鼠血清中il-5、ecp的影響AR是IgE介導的I型變態反應性疾病,其發病機理復雜,有多種炎癥細胞及多種細胞因子參與,其中嗜酸性粒細胞(EOS)作為變態反應主要效應細胞,其功能與其所產生和釋放的化學性介質,顆粒相關蛋白和某些細胞因子有關。嗜酸性粒細胞產生的強堿性蛋白顆粒,如ECP和MBP等,具有很強的細胞毒性和神經毒性。這種EOS既存在于組織中,又存在于循環血液中,因此激活的MC脫顆粒不僅可激發鼻部癥狀,而且可以改變EOS的密度,使EOS的代謝活性大大增強,釋放其內的顆粒,導致組織的炎癥,進而產生一系列AR的臨床癥狀。研究發現,IL-5是調節EOS功能最重要的細胞因子,在變態反應性炎癥組織中處于樞紐地位,促進變應性鼻炎等變態反應性疾病的發生。ECP反映了EOS的活化程度,已被看作是變態反應性炎癥活化的指標,具有一定的致炎作用,許多研究表明ECP可誘導嗜堿細胞和肥大細胞釋放組胺從而誘發AR。祖國醫學認為,脾主運化,為后天之本,氣血生化之源,脾虛易致水濕運化失常,且機體抵抗力下降,易受外邪的侵襲,這可能是導致變應性鼻炎發病的重要原因之一。本實驗結果顯示脾虛組大鼠模型造模結束后均出現了脾虛癥狀,如逐漸消瘦、便溏甚至腹瀉、反應遲鈍、活動減少、毛發失去光澤等,提示脾虛實驗模型的成功。在基礎致敏2周后,應用OV進行鼻腔局部攻擊時,脾氣虛AR組動物出現抓鼻、打噴嚏、流清涕等癥狀的積分值明顯高于AR組,鼻分泌物及血中嗜酸細胞的含量,脾氣虛AR組亦高于AR組,說明在相