黃連解毒湯對大鼠血漿中38個入血成分的lc-f-icr-ms分析

黃連解毒湯是解毒的代表方劑。它被記錄在《肘后急方》中。這個名字開始出現在《外臺秘密》中。該項目已有1700多年的使用歷史。本方由黃連、黃柏、黃芩、梔子4味藥按3∶2∶2∶3配伍組成,具有瀉火解毒之功效。現代臨床廣泛應用于心腦血管、炎癥、老年癡呆、糖尿病等,具有抗菌、抗炎、抗氧化、神經保護等廣泛的藥理活性。環烯醚萜類、生物堿類和黃酮類是其主要的化學成分,但其活性物質基礎卻未予明確闡釋。在中藥復雜成分體系研究中,普遍認為被吸收入血的成分是發揮藥效的活性成分,分析中藥口服給藥后血液中的成分是快速、準確地研究中藥藥效物質基礎的有效途徑。近年來對中藥復方的代謝產物分析日益深入,關于黃連解毒湯的研究多是對少數幾個成分的血藥濃度測定,但這些成分僅是黃連解毒湯中幾個較為常見的化學成分,不能代表整個復方的代謝情況;對其入血成分全面分析鑒定的研究僅一篇文獻報道,該研究使用LC-IT-MS方法僅對一個時間點的血液樣品進行了檢測,容易漏去一些入血成分,使用儀器相對落后,難以實現結構推導的快速準確。本文采用LC-FT-ICR-MS法,分別在正負離子掃描模式下,對多個時間點的血漿混合樣品進行檢識和結構確認,并通過標準品比對進一步確認結構推斷的正確性,對黃連解毒湯入血成分進行了更為全面準確的分析,共發現38個入血成分,包括22個原形成分和16個代謝產物。樣品、試劑和儀器儀器與試藥Agilent1260系列高效液相色譜儀(在線真空脫氣機-低壓四元梯度泵-自動進樣器-柱溫箱);BrukerFT-ICR-MSsolarixMaldi/EDI9.4T(傅立葉變換離子回旋共振高端質譜儀)。黃連(RhizomaCoptidis)、黃芩(RadixScutellariae)、黃柏(CortexPhellodendriChinensis)、梔子(FructusGardeniae)均產自道地產區,經中國中醫科學院中藥研究所何希榮教授鑒定為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根(編號:SB-0315)、毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的干燥根莖(編號:CC-0311)、蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹皮(編號:PC-0311)和茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(編號:GJ-0311),樣品保存于中國中醫科學院中藥研究所。對照品梔子苷、雞屎藤次苷甲酯、京尼平-龍膽雙糖苷、京尼平苷、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A苷、漢黃芩素、千層紙素A均由本課題組分離得到,黃柏堿、木蘭花堿購自北京賽百草科技有限公司,純度均達到95%以上。色譜純乙腈、甲酸(Fisher公司);實驗用水為去離子水由杭州娃哈哈公司提供,其余試劑均為分析純。實驗動物SD大鼠,雄性,體重(200±20)g,等級SPF,由軍事醫學科學院實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(軍)2007-004。黃連解毒湯粉末制備上述4味中藥粉碎,按比例3:2:2:3混勻,依次用10倍量、8倍量水,提取兩次,每次1.5h,過濾,合并濾液,濃縮,80℃減壓干燥。提取物及對照品配制取黃連解毒湯粉末15mg置10mL量瓶,60%甲醇定容,超聲15min,0.22μm微孔濾膜濾過,進樣10μL。分別精密稱取各對照品,加適量甲醇溶解定容,配制混合對照品溶液,0.22μm微孔濾膜濾過,進樣10μL。色譜條件色譜柱為AgilentZorbaxSB-C18column(250mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸),梯度洗脫:0~5min,10%~30%甲醇;5~20min,30%~40%甲醇;20~40min,40%~50%甲醇;40~50min,50%~60%甲醇;50~60min,60%~100%甲醇;60~65min,100%甲醇。流速1mL·min-1柱溫為30℃。質譜參數電噴霧離子化源(ESI),氮氣作載氣,分流比1∶4,檢測電壓4kV;霧化氣壓力1bar;干燥氣溫度180℃,流速4min·L-1;掃描范圍m/z100~1000,正負離子均采集,采集數據用FTMScontrol2.0控制軟件。生物樣品采集及處理SD大鼠3只,給藥前禁食12h,自由飲水。灌胃給予黃連解毒湯粉末1g/100g(生藥50g·kg-1),給藥后1、1.5、2.5和3.5h由眼眶靜脈叢取血各1mL于肝素處理離心試管中,給藥前取血作為空白,離心(4℃3000r·min-1)10min,分離上層血漿樣品,精密吸取200μL,置于2mLEP管中,依次加入1%維生素C溶液10μL,渦旋3min,再加入600μL乙腈,渦旋振蕩5min,8000r·min-1條件下離心15min,上清液全部轉移至干凈的2mLEP管中,40℃水浴中氮氣吹干,殘渣用60%甲醇100μL復溶,渦旋混合,10000r·min-1條件下離心5min。取給藥后4個時間點各50μL混勻,進樣20μL。數據分析根據測得的精確相對分子質量,應用Dataanalysis4.1處理軟件在規定的誤差范圍內(誤差在±5ppm內)計算可能的元素組成,并結合各個成分峰的二級質譜碎片信息和文獻報道數據及對照品比對,對色譜峰進行定性分析。黃酮類質譜裂解分析本研究應用LC-FT-ICR-MS方法,在正負離子模式下檢測黃連解毒湯提取物、空白血漿樣品和給藥血漿樣品,通過比較保留時間和質譜信號,共得到了38個入血成分,其中原形22個,代謝產物16個,并通過高分辨信號推導、比對文獻和對照品參照確認了結構。給藥后4個時間點混合樣品入血成分的提取離子流圖如圖1所示。22個原形入血成分包括5個環烯醚萜(峰1~3、6和7)、7個生物堿(峰4、5、8~12)和10個黃酮(峰13~22)如表1所示。在這些成分中,有16個峰通過對照品比對得到了結構確認;峰1、14~16、19和20通過高分辨數據及文獻比對得到解析。1.3黃酮類質譜裂解分析入血的10個黃酮,除14和16兩個二氫黃酮外,其余均為黃酮,它們有相同的裂解規律,在質譜中表現為連接的葡萄醛酸信號不穩定,容易斷裂,丟失176Da的信號,形成苷元碎片。在苷元上,連接的羥基、甲氧基容易斷裂,形成丟失16Da和30Da的碎片離子信號。以漢黃芩苷(18)為例,其分子離子峰[M+H]+和[M+Na]+分別為m/z461.1079(C22H21O11,error-0.1ppm)和m/z483.0899(C22H20NaO11,error-0.2ppm),二級信號m/z285.0755(C16H13O5)為脫去一個葡糖醛酸的信號,為漢黃芩素,漢黃芩素容易脫去一個甲基信號,得到m/z270.0523(C15H10O5)的碎片離子,與文獻報道一致。化合物14和16,在負離子模式下響應較好,[M-H]-準分子離子峰均為461,從母離子和子離子高分辨數據看出,它們均較千層紙素A和漢黃芩素多出2個H,與文獻比對,推斷為二氫千層紙素A-7-O-葡萄糖苷和其取代基連接位置不同的同分異構體。2葡糖醛酸代謝產物的鑒定16個代謝產物成分包括2個環烯醚萜(M3,M5)、9個生物堿(M1、M2、M4、M6~M11)和5個黃酮(M12~M16),如表2所示。從這些代謝產物可以看出,除M11為一相代謝產物外,其他均為葡糖醛酸和硫酸化二相代謝產物,硫酸化代謝產物在負離子模式下有較強的響應。2.1環烯醚萜類代謝產物分析M3的分子離子峰[M-H]-為m/z305.0335(C11H13O8S,error0.6ppm)和M5的分子離子峰[M+Na]+為m/z425.1054(C17H22NaO11,error0.1ppm)分別較京尼平多出80Da和176Da,這兩個信號在質譜中表現為脫去硫酸和葡糖醛酸的特征中性離子丟失。同時,在二級信號中出現了京尼平的特征碎片信號,m/z207.0662(C11H11O4)和m/z249.0727(C11H14NaO5)分別為[M-H-SO3-H2O]-和[M+Na-GluA]+的碎片離子。2.2生物堿類代謝產物分析M1分子離子峰[M]+為m/z518.2020(C26H32NO10,error0.1ppm),丟失一個176的中性離子,得到其二級碎片m/z342.1018(C20H24NO4)和m/z192.1018(C11H14NO2),二級碎片與黃柏堿一致,故推斷為黃柏堿的葡糖醛酸化代謝產物。M11的分子離子峰為m/z322.1074(C19H16NO4,error0.1ppm)較小檗堿(C20H18NO4)少一個CH2,故推斷其為小檗堿脫1個甲基的代謝產物,為一相脫甲基反應,但由于存在兩個甲氧基基團,不能確定哪個位置脫落。M9分子離子峰為m/z498.1394(C25H24NO10,error0.2ppm),丟失一個176的中性離子,得到二級碎片為M11,故推斷為M11的葡糖醛酸代謝產物,其質譜圖如圖3所示。M7、M10和M2分子離子峰分別為m/z484.1238(C24H22NO10,error-0.1ppm)、m/z484.1237(C24H22NO10,error0.2ppm)和m/z660.1554(C30H30NO16,error0.7ppm),分別丟失1、1和2個176的中性離子,得到二級碎片為m/z308(C18H14NO4),該碎片較小檗堿少兩個CH2,故推斷這3個代謝產物分別為小檗堿去二甲基的1,1,2葡糖醛酸代謝產物。M6分子離子峰[M]+為m/z514.1708(C26H28NO10,error0ppm),丟失一個176的中性離子,得到其二級碎片m/z338.1384(C20H20NO4),二級碎片與藥根堿一致,故推斷為藥根堿的葡糖醛酸化代謝產物。M4和M8的分子離子峰分別為m/z500.1554(C25H26NO10,error0.9ppm)、m/z500.1551(C25H26NO10,error0ppm),各丟失1個176的中性離子,得到二級碎片為m/z324(C19H18NO4),該碎片較藥根堿m/z338.1384(C20H20NO4)少一個CH2,故推斷這兩個代謝產物均為藥根堿去甲基的葡糖醛酸代謝產物。2.3黃酮類代謝產物分析M16、M12和M14分子離子峰分別為m/z447.0923(C21H19O11,error-0.3ppm)、m/z645.1064(C27H26NaO17,error-0.3ppm)和m/z623.1243(C27H27O17,error0ppm),分別丟失1、1和2個176的中性離子,得到二級碎片為黃芩素m/z271(C15H11O5),故推斷這3個代謝產物分別為黃芩素的1、1、2葡糖醛酸代謝產物。M13分子離子峰為m/z609.1454(C27H29O16,error-0.6ppm),二級丟失了一個162和176,故推斷該代謝產物為黃芩素的葡萄糖、葡糖醛酸化產物。以上數據均與文獻報道一致。M15分子離子峰為m/z637.1401(C27H29O17,error-0.3ppm),丟失2個176的中性離子,得到m/z285(C16H13O5)的信號,可能為漢黃芩素或千層紙素A二葡糖醛酸代謝產物。效物質活性成分分析入血成分的質譜裂解特性本研究在前期對該復方化學成分研究基礎上,對黃連解毒湯入血成分進行了較為深入的探討,使用了LC-FT-ICR-MS技術,分析鑒定了黃連解毒湯在大鼠血漿中以原形或代謝產物存在的主要形式。在預實驗中,作者發現該復方中的多數生物堿及環烯醚萜血藥濃度達峰時間在4h之前,黃芩中的黃酮類成分雖出現雙峰現象,但第一次達峰時間也早于4h,與文獻報道一致。因此,本研究通過對1、1.5、2.5和3.5h等4個時間點的血漿混合樣品進行分析,全面展示了黃連解毒湯在大鼠血漿中的存在形式。此外,借助于LC-FT-ICR-MS的超高分辨率和精確質量數,可計算得到代謝產物及其二級質譜碎片的元素組成,極大提升了代謝產物結構鑒定的準確性。同時,在實驗中使用的16種結構明確的對照品也進一步加強了黃連解毒湯入血成分鑒定的可靠性。綜上,本研究為揭示黃連解毒湯清熱解毒藥效物質活性成分藥代動力學研究奠定了基礎。1.1環烯醚萜類質譜裂解分析入血成分中5個原形環烯醚萜均為苷類,除京尼平-龍膽雙糖苷連有兩個葡萄糖外,其余4個均連有一個葡萄糖。由于它們之間有相似的結構,所以在質譜信號中,體現相似的裂解規律。其裂解規律如下:從結構上看,連接的葡萄糖信號不穩定,容易斷裂,丟失162Da的信號,形成苷元碎片。在苷元上,連接的羥基、亞甲醇基、羧甲基容易斷裂,形成相應的碎片離子。以梔子苷(2)為例,進行裂解規律的推導(圖2),其分子離子峰[M+Na]+為m/z427.1210(C17H24NaO11,error0.1ppm),二級信號m/z265.0684(C17H14NaO6)與分子離子峰相差162,提示為脫去葡萄糖的信號,265到m/z247.0578(C11H12NaO5)表示脫去1分子H2O,m/z233.0423(C10H10NaO5)較247少14,脫去了亞甲基的碎片離子,m/z215.0316(C10H8NaO4)較233少18,在此