第五章醫藥生物技術產品的后處理工程

后處理工程通常稱之為下游工程(DownstreamProcessing);它泛指從工程細胞或工程菌的大規模培養一直到目的產物的分離純化、質量控制、產物保存等一系列操作技術，其中最重要的組成部分是產物的分離純化。本章主要介紹細胞破碎與固液分離，目的產物的分離純化，質量控制及產品的保存。第一節細胞破碎與固液分離細胞壁由堅固的多聚糖，乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸形成網狀結構，這種結構，有一定的阻力，針對這種結構，細胞破碎方法分為機械和非機械兩種方法。機械破碎法高速勻漿法(HighPressurehomogenizer)高速珠磨法(High-speedbeadmill)超聲破碎法(Ultrosonication)高壓擠壓法:本方法是用特殊裝置X-Press擠壓機.非機械破碎法酶溶法(EnzymaticLysis):

常用的溶酶有溶菌酶(Lysozyme),葡聚糖酶(Glucanase),蛋白酶(Protease),糖苷酶(Glycosidase),甘露糖酶(Mannanase),肽鍵內切酶(Endopeptidase),殼多糖酶(chitinase)等。2.化學滲透法（ChemicalPermeation）:這種方法的優點是：a.對目的產物的釋出有一定的選擇性；細胞外形保持完整，碎片少，有利于進一步分離純化；分子量大的核酸釋出少，漿液黏度低，有利于提取；其缺點是：操作時間長，效率低，一般胞內目的產物釋放率不超過

50%，而處理時間在2小時以上，因此為了防止活性損失往往需要加添還原劑（巰基乙醇）進行保護；b.有些化學試劑本身有毒性，進一步分離純化時需通過透析等方法除去所有試劑。固液分離離心沉淀:

離心是固液分離的主要手段,其中包括高速離心和超速離心.過濾:

過濾包括粗濾(布、金屬網、纖維濾器等)和膜過濾。第二節目的產物的分離純化目前分離純化最好的方法是色譜和電泳，但是受各種因素的限制，電泳遠不能用于醫藥生物技術產品的規模生產上，因此色譜成為人們研究的重點。另外，雙水相萃取也是前期分離常用的方法。雙水相萃取

雙水相系統由兩種水溶高聚物如聚乙二醇~葡聚糖(PEG-Destran)或一種高聚物與無機鹽在水溶液中混合而成。因兩相均含有較多的水,所以稱之為雙水相。常用的雙水相系統為PEG-Destran和無機鹽。由于Destran價格高，因此PEG-無機鹽應用更為廣泛。與色譜分析相比。雙水相萃取所能達到的純度還相差較遠。二.色譜技術色譜技術是醫藥生物技術下游過程精制階段的常用手段。其優點是具有多種分離機制、設備簡單、便于自動化控制以及分離過程中無發熱等有害效應。色譜技術可分為分析色譜（10mg)、半制備色譜（10~50mg）、制備色譜（100mg~10g）和工業性生產色譜（20g/d）。

在傳統的色譜技術基礎上，七十年代以來，發展起來的高效液相色譜（HighPerfomanceLiquidChromatographyHPLC）引人注目。HPLC的分離原理和常規色譜技術相似，它的特點是具有專有的高壓輸液系統、靈敏的檢測設備和高效分離柱，其優點是分離效率高、選擇性好，適用于各種多組分混合物的分離，它的應用范圍幾乎包括了所有的物質類型，從天然產物到合成產物，從小分子物質到大分子物質，從一般化合物到生物活性物等。HPLC既是精細的分離純化方法。也是快速靈敏、準確、簡便的分析檢測手段。體積排阻色譜

(SizeExclusionChromatography,SEC)SEC一般能分離的分子量范圍為1~200萬；平均粒度為3~13μ。2.離子交換色譜(IonExchangeChromatography,IEC)

離子交換色譜的基本原理是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換而達到分離。對生物大分子進行分離純化可采用兩種方式：（1）.是將目的產物離子化，被交換到介質上，而雜質不被吸附，從柱中流出，稱之為“正吸附”其優點是目的產物純度高，而且可達到濃縮目的。（2）.另一種方式是將雜質離子化后被交換，而且目的產物不被交換直接流出，這種方式稱之為“負吸附”。采用這種方法可除去50%~70%的雜質，適用于目的產物濃度較高的工作溶液。反相色譜

(ReversedPhaseChromatography,RPC):RPC是基于溶質，極性流動性和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜方式。4.疏水作用色譜(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)HIC的原理與PCR相似，區別是HIC填料表面的疏水性沒有RPC強，可用填料有有機聚合物(交聯瓊脂糖Sepharose12，乙烯聚合物等)和大孔硅膠鍵合相兩類。親和色譜（AffinityChromatography,AC）AC是利用生物大分子特異的親和力而建立的層析技術。親和分析的過程大致分為三步：a.配基固定化，選擇合適的配基與不溶性支撐載體偶聯或共價結合成具有特異親和性的分離介質；b.吸附目的物，親和層析介質選擇性吸附目的蛋白，而雜質與層析介質間沒有親和作用，不被吸附，可經洗滌去除；c.樣品解析：選擇合適的條件，將吸附在親和介質上的目的物解析下來。抗體親和層析的步驟是：a.用純化的目的基因蛋白質產品免疫動物，獲得抗體；b.把抗體置于親和層析柱上，然后使基因工程制備的含有多種雜蛋白的混合液，通過層析柱，具有目的基因的蛋白質產物可與柱上的抗體發生親和結合；c.洗脫柱上蛋白質，可以得到高度純化的產物。電泳分離技術

電泳技術分離純化的基本原理是：蛋白質或多肽分子是含有可帶正電荷的氨基、亞氨基、酰胺基等和可帶負電的羧基、苯酚基、巰基等的兩性生物大分子，帶有正電荷的蛋白質分子在電場作用下向陰極方向移動，而帶負電荷的蛋白質分子向陽極方向移動。

平板電泳：

平板電泳分為水平平板電泳和垂直平板電泳種方式。2.連續凝膠電泳：連續凝膠電泳實質上是垂直聚丙烯酰胺凝膠平板電泳的發展，實現了在同批次連續把各個電泳區帶分離回收，并可進行多批次的分離操作。等點聚焦電泳:含有多氨基，多羧基的一系列聚合物混合形成的兩性電解質，在電場作用下，可以形成一個從陽極到陰極PH值逐漸增加的PH梯度。當不同的蛋白質處在這種環境時，處于比其等電點低的PH環境中的蛋白質會帶正電荷，向陰極方向移動，反之向陽極方向移動，在移動的過程中隨著環境PH的改變，逐步達到與其等電點相同的PH環境中，這是其所帶電荷為零在電場不再移動而形成區帶，從而達到不同蛋白質分離的目的。4.連續流動電泳：連續流動電泳是在紙電泳的基礎上發展起來的，以濾紙為載體，將欲分離的樣品以固定方式不斷加在濾紙上（加陽點位置根據組分的電泳行為確定）。在電場作用下帶不同電荷的組分隨電泳緩沖液向前流動的同時，向不同電極方向移動，在濾紙表面形成不同的拋物線狀的遷移軌跡，在濾紙末端剪成鋸齒狀，分別接收流出的各個組分，達到分離末端物的目的。無載體連續流動電泳:

這種電泳的原理是，含蛋白質的溶液沿平板表面流動，形成液膜，在液膜兩側加上電極，隨著液膜向前流動的同時，又向電極方向遷移，形成拋物線軌跡，使它們彼此分開，分別收集即可達到分離的目的.名稱來源色譜種類Lymphocyto膜受體AC重組人白介素-2人登革病毒克隆抗體重組A蛋白基因工程徑向離子交換色譜徑向離子交換色譜徑向離子交換色譜+疏水色譜鋪酶Q10反相HPLC重組人干擾素-?基因工程高效疏水色譜核糖體蛋白大腸桿菌中高效離子交換或高效排阻色譜重組人胰島素(BHI)基因工程反相HPLC谷胱甘肽硫轉酶人胎盤反相HPLCα-巨球蛋白豬血漿染料親和色譜、鋅螯合親和色譜α-淀粉酶工業粗酶高效親和色譜α-干擾素基因工程高效親和色譜表1.某些生物大分子的分離和純化表2幾種檢測目的物純度方法的比較HPLCSDSIEFCE分離機制極性-非極性分配;分子大小;離子交換電荷；等電點；分子大小電荷等分析所需時間10~120min幾小時10~30min分辨率好好好樣品體積10~50μl1~50μl1~50μl靈敏度范圍納克-微克納克-微克皮克定量準確性+++檢出方式紫外、熒光、折射、電化學、放射性染色（可見或熒光）、銀染；放射自顯影同HPLC儀器價格中-高中-低中-高日常消耗低高低自動化√有限√人力操作低高低配備級√√微量級制備收集樣品√√較困難第三節目的產物的質量檢控純度分析常用的純度檢測方法有:PAGE、SDS、毛細管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC等，也可用一些化學方法，如觀察末端是否均一等。氨基酸分析

氨基酸分析可以用自動分析儀進行，氨基酸分析可分為柱后反應法和柱前反應法兩類。重組蛋白質的濃度測定和分子量測定

蛋白質的濃度測定；紫外法比較方便，又不損耗蛋白質樣品。在未知摩爾消光系數的情況下，可以簡單地測定280nm和260nm光吸收值，然后用公式計算：蛋白質濃度(mg/ml)=1.55A-0.76A260