實驗13cDNA的合成及RT-PCR法研究基因的表達

原理：逆轉錄PCR，或者稱反轉錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。基因表達檢測有幾種方法，主要包括原位雜交、Northern實驗、RNA酶保護實驗，Real-tinePCR以及半定量RT-PCR等。其中半定量RT-PCR由于操作簡單，檢測mRNA水平的表達靈敏，被作為檢測基因表達的主要手段之一。RT-PCR是指將逆轉錄(ReverseTranscription；RT)反應和PCR(PolymeraseChainReaction)反應組合在一起的方法，其主要是以管家基因（beta-actin或GAPDH）作為內參，對某一基因在mRNA的水平上進行檢測或定量。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR還可用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。(檢測基因表達的方法)RT-PCR的模板可為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一只管中順次進行。兩步法程序:Inthefirsttube,first-strandcDNAsynthesisisperformedunderoptimalconditions,usingeitherrandomhexamers,oligo(dT)

primers(generatingacDNApool),orsequence-specificprimers.AnaliquotoftheRTreactionisthentransferredtoanothertube(containingthermostableDNApolymerase,DNApolymerasebuffer,andPCRprimers)forPCR.優點:ThismethodisusefulforexperimentswheremultipletranscriptshavetobeanalyzedfromthesameRTreactionorforspecificapplicationssuchasDifferentialDisplayReverseTranscription(DDRT)orRapidAmplificationofcDNAEnds(RACE).Also,sincetheRTreactionisperformedunderoptimalconditions,thisapproachproducesthelongestRT-PCRproducts(upto14kbinlength,iftheappropriateenzymesareused).RT-PCR常見問題分析及其解決方案二、實驗目的1、學習基因特異性引物的設計。2、學習和掌握RT-PCR的原理和方法。3、學習和掌握用半定量RT-PCR對基因表達水平進行相對定量的原理和方法。三、實驗程序

1.提取RNA，通過OD值測定對RNA樣品進行定量。2.RNA的純化及RNA中DNA的去除3.根據基因序列設計擴增目的基因以及看家基因的引物。

4.RT-PCR擴增目的基因及看家基因。

5.產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析結果。

一.擬南芥總RNA的提取

二.RQ1RNase-FreeDNase消化總RNA去除DNA污染1.建立如下反應體系:RNAinwaterorTEbuffer40ul10×reactionbuffer10ulRQ1RNase-FreeDNase(1U/ug/RNA)40ulDEPC處理水10ul2.37℃30min3.加等體積水飽和酚:氯仿,12400rpm,15min4.取上清到一新eppendorftube中,加2.5倍體積的無水乙醇,12400rpm,15min.5.70%乙醇洗滌一次,加50ulDEPC處理水溶解,-20℃保存.

三.快速mRNA純化

一.快速mRNA純化試劑盒說明(深圳依諾金生物科技有限公司)60min可充分回收mRNA,回收率達到90%;

對各種劑量的起始總RNA均能靈活適應(50-50