針刺激活下丘腦室旁核神經元及氫化可的松敏感神經元的穴位特異性研究

中風側核（pvn）是具有分泌交感神經激素的主要核團。在提到的小細胞亞核中，有許多促進腎上腺皮質激素釋放（crh）、神經科學家、腦咖啡因和促甲狀腺釋放激素。這些激素通過下丘腦-垂體軸形成了應激反應的主要成分。當應激源到達下丘腦的PVN時,CRH神經元合成并釋放CRH到達腺垂體,刺激垂體分泌促腎上腺皮質激素(AdrenocorticotropicHormone,ACTH),ACTH隨血液循環而作用于腎上腺,促使腎上腺皮質合成和分泌糖皮質激素。糖皮質激素能通過負反饋作用,調節下丘腦、海馬和其他邊緣系統結構,影響覺醒、認知、情感等功能。本研究通過“在體”記錄下丘腦室旁核熱刺激(一種應激刺激)及氫化可的松(一種糖皮質激素)敏感神經元,并以該神經元放電為指標,觀察針刺不同部位的20個穴位對該神經元激活效應及強度差異,遴選這種效應的特異性相關穴位,并進一部驗證特異性相關穴位對外周血皮質酮水平的影響,以探討針刺調節下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸功能的穴位特異性,為臨床針灸調節機體內環境平衡、增強對外界變化適應能力的選穴提供理論依據。1方法1.1皮膚組織病理學觀察Sprague-Dawley大鼠,體質量240～280g,由中國科學院遺傳與發育生物學研究所提供(SCSK-2002-0016),為普通級動物。標準嚙齒類動物飼料分籠喂養,室溫20±2℃,光照12h。實驗動物的使用嚴格遵守實驗動物的管理及倫理委員會的規定。造模:10%烏拉坦麻醉(腹腔注射1.1ml/100g)。右側頸部剪毛,碘酒、酒精消毒后沿頸靜脈走行剪開頸部皮膚(<1cm),分離頸靜脈至遠心端及遠心端分支處,于遠心端套線(4-0)牽拉頸靜脈,用細塑料管(Φ0.2cm)緩慢插入頸靜脈向心端,固定,觀察無滲血后4-0線縫合切口。細塑料管另一端與三通相連,分別與1%肝素及氫化可的松注射液(先用無水乙醇配成濃縮液,使用時再用0.9%生理鹽水稀釋,10mg/kg靜脈注射)相連。全部操作均在無菌條件下進行。在上述手術完成之后,將大鼠移至KOPF-900型大鼠立體定位儀上,呈俯臥位,雙耳用耳棒固定,上齒鉤掛在鼠頭夾中,口鼻部用鼠頭夾夾緊。于顱正中線縱向切開皮膚,分離切除皮下組織,去除骨膜暴露出前后囟,將前后囟調至同一水平面。參照大鼠腦圖譜(Paxions和Watson,2006)標定下丘腦室旁核在顱骨二維坐標的位置:后囟前6.9～7.4mm,旁開約0.4～0.9mm。在此范圍中央先用顱骨鉆鉆開一小孔,再用咬骨鉗沿鉆開的小孔小心地剔除約5×3mm2的顱頂骨,然后在顯微鏡下用游絲鑷去除腦膜。1.2大鼠臟器電活動激發活性神經元的相關穴位刺激采用充灌1%滂胺天藍的玻璃微電極(尖端小于0.5μm,阻抗為15～20MΩ),在液壓微電極操縱器(SM-25C日本)控制下根據室旁核的三維空間坐標定位(后囟前6.9～7.4mm,旁開約0.4～0.9mm,深度約前后囟水平下7.6～8.6mm),將記錄微電極插入室旁核,當記錄微電極在下丘腦室旁核記錄到神經元電活動時分別進行以下操作:48℃熱水浸燙大鼠2/3尾巴,如果神經元電活動增強(≥20%),為下丘腦室旁核熱刺激敏感神經元。將熱水移開,待神經元電活動恢復到接近基礎放電水平,給以靜脈注射氫化可的松(Sigma,先用無水乙醇配成濃縮液,使用時再用0.9%生理鹽水稀釋,10mg/kg靜脈注射),如果神經元電活動抑制(≥20%),待神經元電活動恢復到接近基礎放電后,分別注射睪酮8mg/kg(Sigma)、雌激素(Sigma,30～50ng/kg)。對熱刺激增強、靜脈注射氫化可的松抑制、睪酮輕微抑制、雌激素無反應的神經元為下丘腦室旁核熱刺激氫化可的松敏感神經元。以該神經元放電為指標,分別觀察針刺不同部位20個穴位對該神經元的激活效應及強度的差異,遴選針刺激活該神經元的特異性相關穴位。不同穴位的刺激要間隔一定的時間,前一個穴位刺激后,待神經元電活動恢復基礎放電后,再進行下一個穴位的刺激。記錄的神經元電活動經微電極輸入DAM50(美國WPI公司)微電極放大器后引入POWERLab(澳大利亞ADInstruments生產)生物機能信號采集分析處理系統,將模擬信號轉換為數字信號傳輸給計算機,并對數字進行分析。1.3電針刺激與局部注射在明確特異性相關穴位基礎上,選用正常成年SD雄性大鼠30只,分別設電針特異性穴位組(電針刺激條件:5/20Hz疏密波,1.5～2.0mA,60min,以刺激局部肌肉出現抽搐反應為度)、非特異性穴位組與對照組,每組10只動物。在動物清醒狀態下,分別施以電針刺激,對照組接受相同處理,只是不針刺,而靜脈血是在針刺結束后即刻斷頭取血。采用酶聯免疫吸附法(Elisa)檢測血漿皮質酮濃度,以探討特異性激活下丘腦室旁核熱刺激氫化可的松敏感神經元的穴位是否也是特異性促進皮質酮分泌的穴位。實驗所用的Elisa試劑盒為CUSABIOELISA試劑盒(CSB-E07014r)。1.4腎經,肝經,各經,三陰交膀胱經:腎俞、肝俞、承山;膽經:京門、陽陵泉;胃經:天樞、足三里;腎經:商曲、腹通谷、筑賓;肝經:期門、章門、太沖;脾經:腹哀、三陰交;督脈:大椎、水溝;任脈:膻中;心包經:內關;心經:神門。1.5統計分析所有數據均用One-Way-ANOVA進行統計分析,以均數±標準差表示。2結果2.1熱刺激可的氫化反應的神經元單位本項研究在下丘腦室旁核共記錄到342個神經元單位電活動,其中有163個神經元單位對48℃熱水刺激有反應(占記錄總數的47.66%),179個神經元單位對48℃熱水刺激無反應(A.占記錄總數的52.34%);在這47.66%的神經元單位中對熱刺激有抑制性反應的42個(B.12.28%),有增強性反應的121個(35.38%)。在35.38%的神經元單位中,71個對氫化可的松無反應(C.20.76%),7個呈增強反應(D.2.05%);而值得關注的是有43個對氫化可的松明顯抑制、注射睪酮輕微抑制、雌激素無反應(E.12.57%)(圖1)的神經元單位。這43個神經元單位為本研究要觀察的下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元。在20.76%對氫化可的松無反應神經元單位中,25個對注射睪酮后呈明顯的抑制反應(F.7.31%),9個對注射β-雌二醇呈一定的抑制反應(G.2.63%),2個有增強反應(H.0.61%)。2.2神經節段穴位間的激活和調節實驗觀察針刺不同部位的20個穴位對下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元的激活效應(圖2A為代表性的神經元電活動圖,2B為分別針刺20個穴位該神經元電活動的統計分析圖)。本項研究結果觀察到,這20個穴位在不同程度上均能激活下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元,這與以往的報道有相似之處[5～9,10]。但通過本項研究也有新的發現,就是這些穴位激活下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元的效應是不同的,神經元電活動由大到小的順序為:腎俞、期門>肝俞>京門>章門>大椎>陽陵泉、腹哀、水溝>太沖、內關>天樞、足三里、三陰交、膻中>神門>商曲、筑賓、腹通谷、承山。與腎上腺位于相同或相鄰神經節段不同經脈穴位間的比較,腎俞、期門、肝俞、京門與天樞、商曲、腹通谷、章門(肝俞、京門除外)、腹哀之間比較差異均有極顯著統計學意義,章門與天樞、商曲、腹通谷之間差異有統計學意義。與腎上腺位于不同神經節段軀干及頭面部穴位間的比較,實驗觀察了大椎、水溝及膻中3個穴位的效應。結果觀察到,腎俞、期門、肝俞與大椎、水溝及膻中比較差異均有統計學意義,而大椎、水溝及膻中3個穴位之間比較差異無統計學意義。位于后肢的穴位比較,足三里、三陰交、陽陵泉、筑賓、承山、太沖之間雖有不同的激活效應,但無統計學意義;而與腎俞、期門、肝俞、京門之間均差異有極顯著統計學意義,與章門、大椎之間差異有統計學意義。位于前肢的穴位內關、神門與后肢的穴位有相同的統計結果。位于同一經脈不同神經節段穴位之間的比較,肝俞、腎俞與承山,京門與陽陵泉,期門與太沖比較差異有極顯著統計學意義。2.3腎認知水平檢測外周血皮質酮水平實驗比較了針刺腎俞與三陰交對皮質酮水平的影響(圖3)。本項研究結果觀察到,針刺腎俞能顯著提高外周血皮質酮水平,與對照組比較差異有極顯著統計學意義(P<0.01);與針刺三陰交比較差異有極顯著統計學意義(P<0.01),說明特異性激活下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元的穴位,也是促進外周血皮質酮水平增高的穴位。3特異性相關穴位的篩選和模型驗證本項研究中,實驗者分別觀察了針刺不同部位的20個穴位對下丘腦室旁核同步記錄的43個熱刺激及氫化可的松敏感神經元的激活效應,遴選了特異性相關穴位,并通過特異性穴位對外周血皮質酮水平的影響,驗證了該穴位也是促進皮質酮分泌的特異性相關穴位。3.1室旁核crh神經元單位電活動下丘腦作為內分泌系統的啟動因素,在下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPAA)中起關鍵作用。下丘腦CRH的神經胞體主要分布在PVN,在受到應激刺激時,PVN的小細胞神經元分泌CRH,有直接激活HPA軸的作用[11～13]。而一定量的糖皮質激素亦可通過HPA軸反饋性抑制CRH的分泌。也就是說,下丘腦室旁核CRH神經元是對應激刺激及糖皮質激素敏感神經元。宋海英等研究發現,在應激狀態下,室旁核各亞核神經元處于分泌活動狀態,尤其以小細胞亞核為顯著。本項研究也觀察到,在下丘腦室旁核有47.66%的神經元對熱刺激有反應,而這些神經元中有對熱刺激有抑制(42)、興奮(121)反應的神經元。本項研究對121個興奮性神經元單位進行了分別靜脈注射氫化可的松、睪酮或雌激素定性分析。結果觀察到,有36個神經元單位靜脈注射睪酮或雌激素出現明顯抑制或興奮,說明這些神經元為性激素分泌相關神經元單位;只有43個神經元是熱刺激興奮、氫化可的松抑制的神經元單位,且對睪酮輕微抑制、雌激素無反應。根據下丘腦CRH神經元的生理特性,我們認為該神經元單位電活動與CRH神經元電活動有相關性,為本項研究的靶神經元單位;至于7個注射氫化可的松興奮的神經元單位可能是CRH抑制性神經元單位電活動,而179個對熱刺激無反應性神經元是與應激刺激無關的其他神經元單位。3.2針刺調節hpa軸功能與腎陰經等部位的關系針刺效應是一個有傳入性影響功能的效應,本項目用電生理學的方法“在體”同步記錄了不同穴位刺激,下丘腦室旁核熱刺激及氫化可的松敏感神經元電活動,進行了與腎上腺位于相同或相鄰神經節段不同經脈穴位間、與腎上腺位于不同神經節段軀干及頭面部穴位間、位于后肢的穴位之間及位于前肢的穴位之間對該神經元的激活效應及強度的比較。結果表明,與腎上腺位于相同或相鄰神經節段不同經脈的穴位之間比較有統計學意義,以膀胱經及肝膽經的穴位對該神經元的激活效應較明顯,且與同經脈遠端穴位相比差異有統計學意義。而膀胱經表里經的腎經穴位雖然也有調節效應,但相對于膀胱經穴位差異有統計學意義。或許是因為支配腎上腺分泌的腎神經的走行更接近膀胱經的走行。而肝膽經的調節效應與中醫理論的肝主疏泄、膽主決斷、參與精神情志活動有關;且肝膽經的走行與兩脅亦較腎經接近腎神經的走行。至于遠端穴位對該神經元的激活效應較局部穴位鈍化。綜合以上結果,針刺調節HPA軸功能既有穴位特異性,又有經脈特異性,兩者相輔相成。腎俞、期門、肝俞、京門為特異性相關穴位,膀胱經、肝、膽經為特異性相關經脈。雖然穴位在相同或相鄰神經節段,但由于經脈所絡屬的臟腑不同,穴位各有不同的主治功能;而雖然位于同一經脈,但由于分布部位的不同,穴位的調節效應亦不同,說明針刺調節HPA軸功能與所屬經脈的主治及解剖部位均關系密切。因此在臨床針刺調節HPA軸功能選穴中,既