苜蓿根際溶磷菌和根瘤菌接種劑的篩選與應用

植物根際的有益微生物是指生活在土壤中或植物根際附近的生物，能夠促進植物生長。植物可以通過固定空氣中的氮（即生物固氮）或溶解土壤中不能直接吸收的磷（即生物溶磷）而刺激植物生長，增強植物吸收礦物和水分的能力，促進植物生長。一些植物還有效地抑制了土壤侵蝕的繁殖和傳播。目前,關于有益微生物分離、篩選以及生理生化特性、分子生物學特性和鑒定方面的研究已經較為深入,研究熱點逐步集中于利用有益微生物制作的生物接種劑或生物菌肥對作物增產、品質改善以及病害防治方面。郜春花等研究表明解磷菌劑可促進玉米(Zeamays)株高、鮮重和干重增加15.2%~89.2%;青菜鮮重、干重和生物量增加15.8%~41.6%。易艷梅等研究發現溶磷菌EnHy-401在鹽堿土壤的良好定殖有助于小麥(Triticumaestivum)生長以及對礦質元素的吸收,其中對P,Ca,K,Mg等礦質元素的吸收率分別提高了34.4%,36.3%,31.5%和6.3%。榮良燕等研究發現促生菌LHS11對黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporiumf.sp.cucumerinum)及西瓜尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.niveum)抑制效果達80%以上,具有較好的應用潛力。因此,利用有益菌研制的接種劑是集促生、防病于一體的“環境友好型”接種劑,是發展綠色食品和生態農業的理想肥料。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)在我國己有2000多年的栽培歷史,既可為家畜提供優質蛋白飼料,又能通過固氮過程改良土壤,培肥地力,是我國西北干旱、半干旱地區人工草地的主要牧草之一。研究表明,接種外源苜蓿根瘤菌是提高苜蓿產量、培肥地力的有效措施。而Sigleton等的研究認為一旦土壤中土著根瘤菌的數量達到一定閾值時,接種根瘤菌并不能產生較大的作用。丁武等引入“土壤載菌量”概念研究根瘤菌數量對競爭結瘤的影響,結果表明土壤具有確定的載菌量,接種量高于土壤載菌量時,接種菌數量不僅不上升,反而部分菌會死亡。因此,單一接種根瘤菌可能對苜蓿的結瘤過程產生抑制作用。我國土壤中有95%以上的磷元素不能被植物直接利用,而苜蓿的結瘤和固氮離不開磷素。王富民等研究表明,磷細菌和固氮菌聯合生長時,對發揮磷細菌的解磷作用十分有利,有助于土壤中水溶性磷的形成。韓光等研究表明在苜蓿上接種溶磷菌和根瘤菌不僅可以培肥地力,還能顯著提高苜蓿產量。因此,有關溶磷菌與根瘤菌互作效應的研究具有重要的意義。本研究利用前期從牧草和作物根際篩選的優良溶磷菌與根瘤菌制作苜蓿根際新型專用接種劑,研究其對苜蓿生長的影響,并篩選出適用于苜蓿的單一及復合菌種接種劑,為苜蓿無公害生產、減少化肥投入量及微生物資源定向利用提供依據和支撐。1材料和方法1.1高原中部降水試驗在甘肅農業大學蘭州牧草試驗站進行(N36.03°,E103.53°),位于蘭州市西北部,地處黃土高原西端,平均海拔1525m,年降水量200~320mm,降雨量主要集中在夏季。供試土壤肥力均勻,土壤類型為黃綿土,黃土層較薄,土壤有機質含量0.84%,pH7.28,土壤含鹽量0.247%,有效氮95.05mg·kg-1,有效磷(P2O5)7.32mg·kg-1,有效鉀(K2O)182.80mg·kg-1。1.2草業科技有限公司選用紫花苜蓿品種阿爾岡金,從甘肅創綠草業科技有限公司購得。供試菌種由甘肅農業大學草業學院草地生物多樣性實驗室提供,具有較強的固氮和溶磷能力(表1)。1.3測試方法1.3.1菌株的制備及接種將LB培養基生長72h的供試菌株分別接種于100mLLB液體培養基中,置于28℃,125r·min-1的搖床培養3~5d,測定OD660值,確保OD660值大于0.5,并用無菌水調節OD660值一致(使菌數量處同一水平),制成菌懸液,按表2所示處理進行菌株單獨或混合施用(注:菌株不論是單獨還是混合,接種總體積要相等,混合菌株體積比均為1∶1或1∶1∶1或1∶1∶1∶1),保存備用。1.3.2菌懸液的制備選用泥炭為載體,pH值調節至6.5~7.0。將該混合體按50g每瓶分裝,每處理3次重復,在121℃下連續滅菌1h備用;將滅菌后的泥炭載體分別倒入無菌自封袋中,用無菌吸管吸取1.3.1制作的各菌懸液5mL接種到自封袋中立即封口,將菌液與載體充分混勻,用滅菌針在自封袋的中央扎幾個小孔,扎孔后的自封袋再外套一自封袋,并在外層自封袋的四周扎幾個小孔,一切操作均在無菌條件下進行。將做好的菌肥置于28~30℃下培養7~10d,之后常溫保存。1.3.3接種劑及化肥用量試驗采用隨機區組設計,共設11個處理,每處理3次重復(表2)。小區面積2m×5m,阿爾剛金種子用量為15kg·hm-2,條播,埂寬30cm,行距30cm。接種劑用量為7.5kg·hm-2,用于拌種。化肥用量:全量磷肥用量為300kg·hm-2(當地常用施肥量),半量磷肥用量為150kg·hm-2,磷肥(過磷酸鈣,P2O5≥14%)作為基肥施用。苜蓿各生育期內不追肥,同時根據自然降雨及視當地干旱情況,以水分狀況滿足苜蓿生長為宜,進行田間常規灌溉。1.3.4苜蓿植株葉綠素的測定有效活菌數:稀釋平板法;苜蓿高度:于2010年分別測定不同處理下苜蓿植株的自然高度,每樣地隨機取30株,取其平均值;葉綠素含量:現蕾期每區每處理取植株上部完全展開的新鮮葉片,用乙醇-丙酮法測定葉綠素;干鮮比:初花期每處理刈割鮮樣1m2,置于室溫下風干,稱樣品干重,計算干鮮比;葉莖比:現蕾期每處理隨機刈割1m2苜蓿植株,將植株葉莖分開,清洗,105℃殺青20min,80℃烘干至恒重后于干燥器冷卻,稱重;干草產量:每茬草產量的測定均在初花期進行,每處理隨機取1m2進行刈割,留茬高度5cm,刈割后曬干稱重,并換算成每公頃的干草產量。1.4處理數據采用Excel2007與SPSS13.0進行數據處理與分析,用LSD法進行多重比較。2結果與分析2.1接種劑有效活菌數測定有效活菌數和是否被雜菌污染是表征接種劑質量的一項重要指標。各接種劑質量檢測結果表明,單一菌種制作的接種劑(單一接種劑,下同)及復合菌種制作的接種劑(復合接種劑,下同)儲存于室溫下經30,60,90,120,150,180d,其有效活菌數均在108個·g-1以上,無污染,符合《微生物肥料》N/Y227-94標準。貯存時間延長至270d,各接種劑處理有效活菌均在108個·g-1以下,且伴有輕度污染和霉變現象,此后有效活菌數迅速下降至102個·g-1,霉變加劇。因此建議各接種劑在6個月內使用,以確保肥效的發揮。6個月有效利用期內,復合接種劑有效活菌數較單一接種劑高,復合接種劑有效活菌數也因菌種不同而不同。如I接種劑與J接種劑在各儲存時段有效活菌數高于G接種劑而低于F接種劑與H接種劑。2.2嫁接劑對三葉草生長的影響2.2.1復合接種劑用量由圖1可知,與A處理(全量磷肥,CK,下同)相比,各接種劑對苜蓿的株高影響各異。復合接種劑的效果優于單一接種劑和CK,單一接種劑不及CK。復合接種劑中除G處理外,其余均較CK的株高增加2.17%~9.00%(第1茬)和1.01%~8.26%(第2茬)。第1茬處理I,J與處理G,H之間差異顯著(P<0.05),第2茬處理G與處理H,I,J差異顯著(P<0.05),其余復合接種劑處理間差異不顯著;單一接種劑處理與CK相比,苜蓿株高有不同程度的下降,且第2茬的下降幅度更為明顯,分別為3.52%~8.93%(第1茬)和5.96%~11.18%(第2茬)。單一接種劑處理之間及與CK差異不顯著。綜上所述,復合接種劑中處理I和J的效果最佳。2.2.2單一接種劑b、c處理由表4可知,苜蓿葉綠素含量因施肥處理的不同差異較大。除D處理外,單一接種劑中B,C,E處理較CK對苜蓿的葉綠素含量影響明顯,第1茬增加1.69%~20.34%,第2茬增加1.28%~19.87%,單一接種劑中B處理的效果最佳,E處理次之,D處理的效果最差;復合接種劑處理的苜蓿葉綠素含量較CK分別增加4.52%~51.98%(第1茬)和13.46%~48.08(第2茬),第1茬除F處理外,G,H,I和J處理與CK差異顯著(P<0.05),第2茬F,G,H,I和J處理均與CK差異顯著(P<0.05)。復合接種劑處理間除I與J差異不顯著外,其余各處理間差異顯著(P<0.05)。這表明復合接種劑處理提高葉綠素含量效果明顯,其中處理I和J的效果最佳。2.2.3莖干鮮比對g處理的影響如表4所示,不同施肥處理下,苜蓿葉莖比和干鮮比變化明顯。復合接種劑處理的效果優于單一接種劑處理和CK,但單一接種劑處理不及CK。施用復合接種劑處理,苜蓿葉莖比較CK增加3.45%~13.79%(第1茬)和4.82%~18.07%(第2茬),而干鮮比增加8.90%~19.57%(第1茬)和11.98%~21.07%(第2茬),其中I和J處理的效果最佳,G處理最差;單一接種劑處理對苜蓿葉莖比和干鮮比的影響程度不同,葉莖比較CK下降16.09%~21.84%(第1茬)和13.25%~25.30%(第2茬),而干鮮比第1茬下降2.71%~14.39%,第2茬下降5.45%~14.65%,單一接種劑中處理E的效果較好。2.2.4復合菌肥處理對苜蓿產量的影響干草產量是衡量苜蓿生產能力的重要指標,對苜蓿干草產量的測定結果如表5所示。各施肥處理對苜蓿干草產量的影響顯著。復合接種劑的效果優于單一接種劑及CK,單一接種劑處理不及CK。施用復合接種劑對苜蓿干草產量增產幅度可達11.98%(第1茬)和20.95%(第2茬),不同復合菌肥處理對苜蓿產量影響亦不同,如復合菌肥處理G與處理F,H差異顯著(P<0.05);單一接種劑中處理E與CK差異不顯著,B,C,D處理與CK差異顯著(P<0.05)。各施肥處理對苜蓿干草產量的促生效果主要體現在第1茬,處理I和J與其他處理差異顯著(P<0.05),且促生效果最佳。苜蓿總干草產量也因菌肥處理的不同而變化明顯,最大增幅可達到15.77%。3復合接種劑對玉米產量的影響隨著社會對環境保護的日益重視和生態農業的發展,微生物肥料作為新興的“綠色產業”在農業生產中發揮著越來越重要的作用。微生物肥料又稱生物肥料、菌肥、接種劑,是含有特定微生物活體的制品,應用于農業生產,通過其中所含微生物的生命活動,增加植物養分的供應量或促進植物生長,提高產量,改善農產品品質及農業生態環境。由于微生物種類繁多、作用機理多樣,體現出多樣化的功能,研發與應用的潛力巨大。微生物肥料主要通過活體微生物的數量來體現,其質量由多種因素決定,包括菌種來源、菌劑組成、菌種組合與比例、載體種類與質量,還受土壤生態環境(水分、濕度、通氣狀況、pH值等)的影響。另外,微生物肥料的施用方法、施用量以及施用時間也因作物不同而有所差異。本研究制作的固體接種劑貯存180d,有效活菌數在2.79×108個·g-1以上,符合《微生物肥料》NY227-94質量標準,接種劑的貯存時間延長至270d,各接種劑處理有效活菌均在108個·g-1以下,且伴有輕度污染和霉變現象,而當保存時間為360d此后有效活菌數迅速下降至102個·g-1,霉變加劇。因此,為了延長各菌肥接種劑的貯存時間,可以嘗試在其中加入一定比例的真菌抑菌劑。近年來,各國學者就生物菌肥的應用潛力進行了大量實踐,如Mohammad等在PGPR和PSM對玉米產量影響的研究表明,接種的菌肥可以顯著提高玉米產量的同時減少50%的磷素供應,但不能補償缺少氮素對其的影響。孫淑榮等報道接種復合制劑對玉米增產效果顯著,玉米平均增產11.01%,增產幅度為7.35%~15.26%,并可替代10%~20%的化肥,減少投入750~1050元·hm-2。本試驗結果表明,各施肥處理對紫花苜蓿的株高、葉綠素含量、干鮮比、葉莖比及干草產量具有明顯的促生效應,增產效果總體呈現復合接種劑+半量磷肥處理>全量磷肥處理>單一接種劑+半量磷肥處理,這與韓文星等在燕麥(AvenasativaL.)上的研究結果一致。本研究結果表明,單一接種劑的接種效果因菌株個體的差異,表現有所不同,如S7+1/2P處理對苜蓿的各項指標促生效果優于其他單一接種劑處理,除與苜蓿根瘤菌S7固有的特性有關,還可能由于土著苜蓿根瘤菌結瘤能力和固氮能力較低,接種外源苜蓿根瘤菌S7(固氮酶活性為1321.36C2H4nmol·m-1·h-1)可有效改善苜蓿根瘤菌的結瘤和固氮能力,進一步提高苜蓿的產量。施用S7+1/2P處理苜蓿葉綠素含量較全量磷肥處理增加16.95%(第1茬)和10.90%(第2茬),對苜蓿株高、葉莖比、干鮮比以及干草產量的影響不及全量磷肥處理,但與全量磷肥的差異不顯著;復合接種劑處理的效果優于全量磷肥處理,以處理I和J的效果最佳,處理G的效果最差。處理J對苜蓿株高、葉綠素含量、葉莖比、干鮮比以及產量分別較全量磷肥增加9.00%,51.98%,13.79%,19.57%,11.98%(第1茬)和8.26%,48.08%,16.87%,20.07%,20.95%(第2茬),這可能與菌株之間的互作效應有關。研究證實,溶磷菌溶解的磷礦粉能作為根瘤菌的磷源,促進其生長繁殖,為植株提供更