第17章核酸技術(shù)

TechnologyofNucleicAcid本章主要內(nèi)容：

DNA重組技術(shù)

基因鑒定核酸技術(shù)的應(yīng)用

對遺傳分子核酸的結(jié)構(gòu)與功能的闡明，用于研究核酸的工具酶的開發(fā)，由核酸的分子雜交性質(zhì)建立起的一系列分析技術(shù)，使我們已經(jīng)能夠按照自己的意愿來擺布和操作基因，去改變生命有機體的遺傳性狀，甚至制造出新的物種，以服務(wù)于人類。重組DNA技術(shù)使人類千百年的夢想變?yōu)榱爽F(xiàn)實。一個夢想已成真生長激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“碩鼠”1.DNA重組技術(shù)DNA重組技術(shù)是利用多種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶等工具酶，以DNA為操作對象，在細胞外將一種外源DNA（來自原核或真核生物）和載體DNA重新組合連接（重組），形成重組DNA，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細胞（如大腸桿菌等），使外源基因DNA在宿主細胞中隨宿主細胞的繁殖而增殖，并在宿主細胞中得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。“基因工程”（geneengineering）或“分子克隆”（molecularcloning）。

基因重組技術(shù)的兩個基本目的1.直接利用基因主導(dǎo)生長的基因、作物的抗性基因、基因診斷、基因治療、指紋圖譜等2.利用基因的表達產(chǎn)物疫苗、藥物、組織激活物、生長因子、珍稀蛋白等50年來，核酸酶學(xué)的進步為DNA的分析與鑒定提供了有力的工具。主要的核酸酶有：

DNA聚合酶（DNApolymerase）

klenow片段，Taq酶

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）逆轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）S1核酸酶（S1nuclease）連接酶（Ligase）拓撲異構(gòu)酶（Topoisomerase）等核酸酶學(xué)限制性核酸內(nèi)切酶——一把神奇的“手術(shù)刀”具有內(nèi)切和甲基化兩種功能能夠識別外源的核酸并將它切除有特異的識別位點，通常為4-8對堿基的旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)在其切口處留下黏性末端（stickyend）——具有互補序列的單股鏈，或者平頭末端（bluntend）有3種類型，II型為主例如：

EcoRI屬種品系排序限制性內(nèi)切酶（有專一的切點并常在切口處留下黏性末端）目的基因克隆的技術(shù)路線獲得目的基因選擇合適的可以攜帶目的基因的載體把目的基因插入到載體中去，得到重組載體將重組載體導(dǎo)入宿主細胞進行克隆（通過無性繁殖，隨著宿主目的基因也得以擴增）對重組的克隆進行篩選使重組的宿主細胞大規(guī)模的表達目的基因黏性末端（如質(zhì)粒，噬菌體等）（如細菌）目的基因克隆的技術(shù)路線利用表型特性，核酸雜交以及免疫化學(xué)等方法對克隆進行篩選目的基因的制備直接從染色體中分離人工合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

cDNA文庫：用細胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備全套cDNA后建庫。構(gòu)建基因文庫

PCR擴增質(zhì)粒是可以獨立復(fù)制并在細菌之間轉(zhuǎn)移的遺傳單位，質(zhì)粒還能賦予宿主菌某種表型其他的基因載體還有如：噬菌體，病毒等目的基因的載體plasmidDNAGenomicDNA含有目的基因的重組宿主細胞（如細菌）可以通過規(guī)模化的基因工程生產(chǎn)目的蛋白（如激素）古埃及一具木乃伊的一個DNA片段已經(jīng)得到克隆打開了人們窺探過去的窗戶2.基因鑒定聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR,DNApolymerasechainreaction）目的基因可以通過以下系統(tǒng)在試管中得以大規(guī)模擴增一個溫度和時間可以控制的反應(yīng)體系含有雙鏈DNA模板耐熱的DNA聚合酶（如Taq酶）一對設(shè)計適當?shù)腞NA引物，dNTP原料，過量經(jīng)“變性---退火---延伸”多次循環(huán)使目的DNA得以擴增DNA核苷酸序列分析Sanger雙脫氧鏈終止法利用一個標記的（如用同位素標記），特異的，單股DNA或RNA片段——探針（probe），可以：研究DNA之間的親緣關(guān)系；發(fā)現(xiàn)基因的缺失或突變；測定某種遺傳信息的量；鑒定某種基因基因治療等分子雜交（Molecularhybridization）分子雜交是一系列基因鑒定方法的基礎(chǔ)

印跡技術(shù)（Blotting）Southernblot——用探針鑒定DNANorthernblot——用探針鑒定RNA原位雜交（Hybridizationinsitu）指紋分析（Fingerpri