慶大霉素抗體在疫苗研制中的殘留分析

在疫苗的開發過程中，需要添加過量的抗生素，如清霉素和卡拉霉，以抑制污染細菌的生長。如果帶入到成品疫苗中抗生素殘留量過高則會導致人的機體產生異常反應,如皮膚潮紅、發癢、心悸、皮疹、呼吸困難,嚴重者可出現休克或死亡,因此應嚴格控制疫苗中抗生素的殘留。在研制過程中即使通過換洗、純化以及最終超濾等工藝,也很難將抗生素全部清除干凈。文章分別選擇了研制疫苗4個生產階段(原液階段、純化前階段、純化后階段以及成品階段)樣品作為樣本,通過抗生素殘留測定,考察疫苗研制的各階段抗生素的殘留和去除。1材料和方法1.1慶大霉素的殘留采用間接競爭ELISA方法,在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原,樣本中殘留的慶大霉素將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗慶大霉素抗體,加入酶標二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與殘留物慶大霉素的含量成負相關,與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數,即可得出該樣本中慶大霉素的殘留量。1.2試驗樣本研制的疫苗原液、160×濃縮液、半成品、成品,均由成都生物制品研究所提供。1.3聚苯乙烯離心管XXXXXX公司微孔板酶標儀型號:XXXXXXXX;2ml聚苯乙烯離心管;微量移液器:單道20～200ml、200～1000ml、多道250ml。1.4標準液的制備1.4.196孔酶標板×1塊(包被有偶聯抗原)1.4.2高濃度標準品(1ml/瓶)1mg/ml及標準液×6瓶(1ml/瓶):0ng/ml,0.1ng/ml,0.3ng/ml,0.9ng/ml,2.7ng/ml,8.1ng/ml。1.4.3酶標二抗12ml,抗體工作液7ml,底物液A液7ml,底物液B液7ml,終止液7ml,20×濃縮洗滌液40ml,2×樣本稀釋液50ml,去離子水。1.5測試方法1.5.1制備將2×樣本稀釋液按1:1稀釋即為1×樣本稀釋液,備用;然后將待測樣品用1×樣本稀釋液稀釋至10倍,即慶大霉素含量為0.1～8.1ng/ml范圍內,取50ml用于分析。1.5.2編號指示將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。1.5.3抗體反應加入標準品/樣本50μl到對應的微孔中,再加入抗體工作液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。1.5.4吸水紙拍干液小心揭開蓋板膜,將孔內液體甩干,用洗滌工作液(見配液1)250ml/孔,充分洗滌4～5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。1.5.5酶標二醇添加加入酶標二抗100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min,取出重復洗板步驟4.4。1.5.6顯色加入底物液A液50μl/孔,再加底物液B液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中避光反應15min。1.5.72結果2.1百分吸光度值計算標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100,即:百分吸光度值(%)=B/B0×100。B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值2.2繪制標準曲線圖以標準品百分吸光率為縱坐標,以慶大霉素標準品濃度(ng/ml)的半對數為橫坐標,繪制標準曲線圖,r2≥0.98,見圖1、表1。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中慶大霉素實際殘留量(表2)。3討論3.1純化工藝對慶大霉素的殘留量的影響通過對疫苗樣本中的慶大霉素殘留量的檢測,不難發現,在疫苗的生產初期的原液及160×濃縮液,慶大霉素的殘留量較高,分別達到20.4ng/ml及30.6ng/ml,經過純化精制后,其殘留量明顯下降近兩個數量級,分別達到0.38ng/ml及0.61ng/ml,可見通過純化工藝,可以大幅度降低疫苗中慶大霉素的殘留量。3.2減少抗生素的使用抗生素類藥物在治療感染性疾病方面發揮了重大的作用,但抗生素濫用會造成嚴重的不良后果。美國、歐盟和中國等都制定了食品中抗生素的最大殘留限量指標,以限制食品中抗生素的殘留量。我國在2010版《中國藥典》中增加相關內容,嚴格控制生物制品生產過程中抗生素的使用。生產過程中,應盡可能避免使用抗生素,必須使用時,應選擇安全性風險相對較低的抗生素,使用抗生素的種類不得超過1種,且產品的后續工藝應保證可有效去除制品中的抗生素,去除工藝應經驗證。病毒性疫苗生產中應僅限于在細胞制備過程中使用抗生素。生產過程中使用抗生素時,成品檢定中應檢測抗生素殘留量,并規定殘留量限值。在新版藥典正文標準中除口服脊髓灰質炎減毒活疫苗糖丸外,所有病毒疫苗全部增訂抗生素殘留量檢測,限值規定為:每1次人用劑量不高于50ng。3.3疫苗純化技術應根據疫苗的使用規定進行鑒于此,在疫苗研發過程中,應首先嚴格控制原輔材料中可能帶有抗生素含量,這類原輔材料主要是生物類原輔材料,如牛血清、水解乳蛋白、胰酶等,同時應考慮和研究使用生物原材料替代物進行疫苗生產;同時調整疫苗的生產工藝,通過降低甚至取消生產過程中抗生素加入和改進疫苗的純化工藝,如增加細胞生長液換洗次數、引進純化技術,盡可能降低抗生素的含量,最終使疫苗安全有效。疫苗中慶大霉素殘留量測定不易掌握,通過摸索學習總結了4點注意事項:(1)室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20～25℃)會導致所有標準的OD值偏低。(2)在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況,則會出現標準曲線不成線性,重