沼氣料液對(duì)木聚糖酶活性的影響

沼氣生產(chǎn)與復(fù)雜而不同的微生物有關(guān)，尤其是像甲烷這樣的細(xì)菌。整個(gè)沼氣生產(chǎn)過(guò)程包括三個(gè)階段:水解、酸化和甲烷形成,每個(gè)階段都由不同的微生物完成。水解階段是微生物來(lái)源的胞外酶(纖維素酶,淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,果膠酶和木聚糖酶)對(duì)有機(jī)物的水解。酸化階段是兼性厭氧的產(chǎn)酸細(xì)菌將水解階段的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為乙醇、有機(jī)酸(甲酸)、氨基酸、硫化氫、痕量甲烷、氫和二氧化碳。產(chǎn)酸細(xì)菌形成的厭氧環(huán)境是產(chǎn)甲烷微生物生長(zhǎng)的前提。甲烷形成階段是專性厭氧的古細(xì)菌群利用氫、二氧化碳和乙酸等合成甲烷。在沼氣生產(chǎn)過(guò)程中,產(chǎn)酸細(xì)菌和古細(xì)菌群形成共生關(guān)系。微生物和酶聯(lián)合處理可以提高沼氣生產(chǎn)效率。用半纖維素酶處理大豆種皮,沼氣得率比對(duì)照提高2倍;甘蔗渣用氫氧化銨和其他試劑處理后,與纖維素酶及半纖維素酶共培養(yǎng),沼氣得率顯著提高。麥桿和豆脂(Cyampsispsoraloidesortetragonalbusseeds,是甘露糖和半乳糖的半乳甘露聚糖,為水溶性膠質(zhì)纖維,由攪碎的Indianclusterbean子胚乳抽取而得)經(jīng)鳳尾菇(phoenix-tailmushroom)生長(zhǎng)處理后,獲得較高的沼氣得率。稻桿經(jīng)側(cè)耳屬真菌處理沼氣得率提高2倍。莽吉柿皮經(jīng)微生物預(yù)處理,沼氣得率比對(duì)照提高8倍。這些研究表明,酶和微生物預(yù)處理可以提高沼氣得率。本研究在證實(shí)沼氣產(chǎn)生過(guò)程中存在木聚糖酶的基礎(chǔ)上,考察了沼氣料液對(duì)外源和內(nèi)源木聚糖酶活性的影響,這將為利用木聚糖酶預(yù)處理工農(nóng)業(yè)廢棄物提高沼氣得率奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1藥品和試劑:egazme樺木木聚糖(Birchwoodxylan)、AZCL-Xylan(Oat,Megazyme)和礦物油(Mineraloil)購(gòu)自Sigma公司,其他藥品和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。721-100型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠),pHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠),PCR儀(Biometra╋,TGRADIENT)。1.2調(diào)ph的測(cè)定沼氣發(fā)酵液4℃下10000r·min-1離心10min,取上清液分成四份,其中三份分別用H2SO4調(diào)pH為6.0,6.5和7.5。1.3清液0.5ml和10.10azcl-xyla-zle-zmot現(xiàn)代圖5在0.5mL離心管中加入不調(diào)pH的沼氣發(fā)酵液上清液0.5mL和10mgAZCL-Xylan(Oat,Megazyme),50℃保溫2h。對(duì)照為沼氣發(fā)酵液上清液121℃滅菌30min。1.4最佳反應(yīng)ph外源木聚糖酶分別來(lái)源于綠色木霉TrichodermavirideYNUCC0183(最適反應(yīng)溫度為50℃,最適pH為6.0),疏棉狀嗜熱絲孢菌ThermomyceslanuginosusYNUCC4154(最適反應(yīng)溫度為73℃,最適pH為6.5),放線菌Streptomycessp.YNUCC0233(最適反應(yīng)溫度為50℃,最適pH為6.5)。上述木聚糖酶均由“造紙工業(yè)用酶制劑的開發(fā)和應(yīng)用”項(xiàng)目組提供。1.5分離及產(chǎn)酶培養(yǎng)基采用礦物油密封-平板稀釋法從沼氣發(fā)酵液(由云南師范大學(xué)農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)中分離兼性厭氧細(xì)菌。分離到的細(xì)菌菌株分別為B5-3,B5-1,克氏桿菌Klebsiellasp.YNUCC0237(S6-1)(30℃培養(yǎng)),B1-1h及B1-2h(50℃培養(yǎng))。分離及產(chǎn)酶培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)修改為(g·L-1):樺木木聚糖10,酵母膏0.5,胰蛋白胨0.5,碳酸氫鈉4,復(fù)合維生素2.5mg,FeCl30.1,微量礦物溶液10mL。分離培養(yǎng)基需補(bǔ)加2%瓊脂。產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝于18×180mm試管中(10mL·管-1),用礦物油密封(4mL·管-1),121℃滅菌后,按2%分別接種72h培養(yǎng)物,靜置培養(yǎng)15d,在4℃下將發(fā)酵液10000r·min-1離心6min,除去礦物油后的上清液即為粗酶液。1.6微生物指標(biāo)檢測(cè)在15×150mm試管中加入40μL一定稀釋度的酶液,360μL木聚糖溶液(0.01g·mL-1,pH5.5,6.0,6.5,7.5,因酶而異),分別加入不同體積的沼氣發(fā)酵液(0,40,100,200,300,400μL),最后補(bǔ)加相應(yīng)pH的Britton-Robinson緩沖液至800μL,在最適溫度的水浴中保溫30min。加入DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑0.5mL,沸水浴煮10min,蒸餾水定容至5mL,搖勻,540nm測(cè)DA值。每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol還原糖(以木糖計(jì))的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。1.7da值測(cè)定在0.5mL離心管中加入40μL一定稀釋度的酶液和360μL底物溶液,用PCR儀設(shè)定溫度10～90℃度梯度,反應(yīng)30min后,95℃保溫10min,將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入在15×150mm試管中,加入0.5mLDNS試劑煮沸10min后加蒸餾水4.1mL,于540nm下測(cè)DA值。1.8pcr法檢測(cè)da分別取不同pH的Britton-Robinson緩沖液配制的0.01g·mL-1木聚糖溶液360μL至0.5mL離心管中,加入40μL一定稀釋度的的酶液,用PCR儀在最適溫度反應(yīng)30min,95℃保溫10min,將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入在15×150mm試管中,加入0.5mLDNS試劑煮沸10min后加蒸餾水4.1mL,于540nm下測(cè)DA值。2結(jié)果與分析2.1沼氣發(fā)酵液中藍(lán)色染料的釋放AZCL-Xylan檢驗(yàn)表明,未處理沼氣發(fā)酵液可以釋放出藍(lán)色染料,121℃滅菌30min的沼氣發(fā)酵液未釋放出藍(lán)色染料,沼氣發(fā)酵液中存在木聚糖酶。2.2木聚糖酶最適溫度的確定圖1表明,克氏桿菌KlebsiellaspYNUCC0237(S6-1)的木聚糖酶最適溫度為55℃,B5-3的木聚糖酶最適溫度為50℃,B5-1的木聚糖酶最適溫度為60℃,B1-1h的木聚糖酶最適溫度為60℃,B1-2h的木聚糖酶最適溫度為60℃。2.3木聚糖酶最適ph的ph圖2表明,克氏桿菌Klebsiellasp.YNUCC0237(S6-1)的木聚糖酶最適pH為6.5,B5-3的木聚糖酶最適pH為6.0,B5-1的木聚糖酶最適pH為5.5,B1-1h的木聚糖酶最適pH為7.5,B1-2h的木聚糖酶最適pH為6.0。2.4對(duì)微生物的催化作用沼氣料液對(duì)不同微生物來(lái)源的木聚糖酶活性影響不同(表1)。當(dāng)沼氣料液的pH調(diào)節(jié)至相應(yīng)木聚糖酶的最適pH后,細(xì)菌B5-3,B5-1,綠色木霉TrichodermavirideYNUCC0183和放線菌Streptomycessp.YNUCC0233來(lái)源的木聚糖酶均表現(xiàn)出對(duì)沼氣料液一定程度的耐受性,但不同來(lái)源的酶所能忍受的沼氣料液比率不同:綠色木霉TrichodermavirideYNUCC0183和兼性厭氧細(xì)菌B5-3來(lái)源的木聚糖酶耐受的比率最高,達(dá)37.5%,放線菌Streptomycessp.YNUCC0233和兼性厭氧細(xì)菌B5-1來(lái)源的木聚糖酶的耐受比率為5%。在上述耐受濃度范圍內(nèi),調(diào)節(jié)pH后的沼氣料液對(duì)酶活表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。對(duì)未調(diào)節(jié)pH的料液,僅有綠色木霉TrichodermavirideYNUCC0183和放線菌Streptomycessp.YNUCC0233來(lái)源的木聚糖酶分別能耐受12.5%和5%的比率。另一方面,無(wú)論是否調(diào)節(jié)pH,沼氣料液均對(duì)兼性厭氧細(xì)菌S6-1,B1-1h,B1-2h和疏棉狀嗜熱絲孢菌ThermomyceslanuginosusYNUCC4154來(lái)源的木聚糖酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。3沼木霉trcho東南角酶法預(yù)處理沼料液從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看,顯然不能采用直接向沼