守宮水蛭組方對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

中風是一種發病率高、死亡率和致殘率相對較高的疾病。近年來,由于搶救技術提高,其死亡率相對減少,然而致殘率仍居高不下。對于中風后遺癥的治療,臨床常用自由基清除劑、鈣拮抗劑、腦細胞活化劑和溶栓劑,但均缺乏特異性,療效不十分理想。傳統中醫藥對此病的治療有幾千年歷史,積累了豐富的理論和方法,開發了不少中成藥,療效不斷提高。我們從臨床實踐中篩選了有效中藥,自擬了“守宮水蛭組方”治療中風后遺癥,顯示了較好的療效。本實驗在模擬中風的大鼠大腦中動脈阻塞—再灌注模型上觀察了自擬的守宮水蛭組方對局灶性腦缺血的保護作用,為推廣應用提供實驗依據。1材料和方法1.1陽性對照藥自擬守宮水蛭組方合劑(由守宮、水蛭、丹參、川芎、菖蒲、郁金、遠志、赤勺等組成)為衡陽市中醫院藥劑科生產。華佗再造丸(HuatuoZaizaoPill,Hua,廣州奇星藥業有限公司產品)和西比靈(鹽酸氟桂利嗪,flunarizinehydrochloride,Flu)膠囊(西安楊森制藥有限公司)作為陽性對照藥。紅四唑(redtetrazolium)為華美生物公司產品,乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒為德國EntronicGmbH公司產品,肌酸激酶(creatinekinase,CK)試劑盒為美國Bioresun公司產品,K+和Na+測定試劑盒為日本Phoenix公司產品,Ca2+和Mg2+離子測定試劑盒為德國Centronic公司產品,其他試劑均為市售分析純。1.2方本細胞組方藥劑小劑量sscs、實證和結果250±50gWistar大鼠48只(南華大學實驗動物部提供),隨機分為6組:缺血再灌組(I/R)、假手術組(sham-operate,SO)、守宮水蛭組方合劑小劑量[2.5mL/(kg.d)]+缺血再灌組(SSCS+I/R)、守宮水蛭組方合劑大劑量[7.5mL/(kg.d)]+缺血再灌組(SSCL+I/R)、華佗再造丸[8g/(kg.d)]+缺血再灌組(Hua+I/R)和西比靈[10mg/(kg.d)]+缺血再灌組(Flu+I/R)。均于手術前6天灌胃給藥,每天2次,第7天最后一次于手術前60min給藥。1.3動脈栓塞方法用10%水合氯醛(300mg/kg)ip麻醉大鼠,仰位固定,頸部正中切口,暴露右側頸總動脈,由分叉處向頭端依次游離,結扎并剪斷枕骨下動脈和甲狀腺上動脈,在頸外動脈遠端結扎并切斷,游離備用。分離頸內動脈,用絲線在頸外動脈根部打一松扣,夾閉頸總動脈和頸內動脈;將尼龍線(長4cm,直徑0.20～0.25mm)經頸外動脈主干切口,緩慢向頸內動脈入顱方向推進,以頸總動脈分叉處為標記,推進20mm左右時感到阻力,到達大腦前動脈內。扎緊頸外動脈根部松扣。1h后,小心拔出尼龍線,扎緊動脈殘端,縫合皮膚,再灌6h,完成大腦中動脈栓塞。假手術組大鼠麻醉后,僅暴露頸內外動脈分叉,不閉塞大腦中動脈。1.4大鼠行駛能力檢測1.4.1大腦中動脈栓塞后6h按Longa的方法對大鼠的行為障礙進行分級評分,標準是:0分為未見神經癥狀;1分為不能完全伸展左側前爪;2分為大鼠置于光滑平面上,推手術側肩部向對側移動時,阻力降低;3分為大鼠自由行走時向左側環轉、轉圈或傾倒;4分為軟癱,肢體無自由活動。積分越高,說明大鼠行為障礙越嚴重。1.4.2斷頭處死大鼠,迅速取出大腦,分別取各組一只大鼠的右大腦半球沿冠狀面切成5片,用紅四唑(2g/L)染色,置37℃水浴避光保溫15min后,正常組織呈紅色,完全梗死組織呈白色。初步觀察可見模型組出現明顯的白色栓塞區,用藥后可縮小梗死面積,說明模型成功。1.4.3取各組大鼠右大腦半球稱濕重,然后80℃烘至恒重稱干重,計算腦組織含水量(%)=[(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重]×100%。1.5乳酸脫氫酶和肌酸激酶大鼠斷頭處死后留取血清用自動生物化學分析儀(Bickman產,Hitachi717型)按試劑盒說明書測定乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量,測定結果以u/L表示。1.6腦梗死超早期生物化學測定稱完干重的大鼠右半腦用優級純硝酸80℃消化,純水定容(5%),用自動生物化學分析儀按試劑盒說明書測定腦組織K+、Na+、Ca2+、Mg2+含量,結果以μmol/g表示。1.7統計處理采用SpssforWindows8.0統計軟件包中的方差分析,兩兩比較用LSD法。2結果2.1左腰椎內收的肢體肌緊張下降大腦中動脈栓塞術后,缺血損傷組大鼠表現出明顯運動功能障礙,提鼠尾可見其左前肢內收緊貼胸壁,左側肢體肌緊張下降,行走時偏向左側;預先服用守宮水蛭組方合劑能不同程度地改善大腦中動脈栓塞大鼠的行為障礙,其作用強度與陽性對照華佗再造丸和西比靈組無明顯差異(表1,Table1)。2.2各組k含量比較缺血再灌注組LDH和CK含量比假手術組顯著升高,不同劑量守宮水蛭組方LDH和CK含量明顯低于缺血損傷組,與假手術組基本一致;守宮水蛭組方合劑不同劑量組血清LDH含量明顯比西比靈組低,也略低于華佗再造丸組(P>0.05),可見在減輕腦損傷某些方面守宮水蛭組方優于西比靈,與華佗再造丸接近(表1,Table1)。2.3對小鼠腦損傷,k+和ca2+含量的影響缺血再灌注損傷后,腦組織Na+含量比假手術組明顯增高,腦組織明顯水腫,K+和Ca2+含量呈升高趨勢但差異無顯著性意義,預防性使用不同劑量守宮水蛭組方合劑降低腦組織含水量及Na+和K+濃度,但對Ca2+和Mg2+含量無明顯影響(表2,Table2)。3對球治大鼠局灶性腦缺血損傷的防治以養腦營養為原則,見表4自擬守宮水蛭組方由守宮、水蛀、丹參、川芎、菖蒲、郁金、遠志、赤勺等組成,方中除守宮外,皆為眾所周知的活血化痰開竅藥。守宮即“壁虎”,別名“天龍”,《中藥大詞典》中稱其具有“祛風、定驚、解毒、散結、治中風癱瘓”等功效;《本草綱目》稱其“善治中風癱瘓、手足不舉或歷節風痛及風疾,血積成痞”,且“守宮以食蝎蚊為主,故其性有似蜈蝎而通經絡,又具化痰行血之性”;《中藥現代研究與應用》謂其“具17種氨基酸,其中含有8種人體必需的氨基酸”,并“具有祛風活絡,散結功能,用于中風癱瘓,風濕關節痛、骨髓炎、淋巴結核、腫瘤”等,故其在方中起主要作用。根據以上理論,我們用守宮水蛀組方防治實驗性大鼠局灶性腦缺血損傷,結果表明,能明顯改善大鼠大腦中動脈栓塞—再灌注損傷的行為障礙并顯著降低血清LDH和CK含量,減輕腦水腫,降低腦組織Na+離子濃度,對局灶性腦缺血損傷有保護作用。且療效及各項指標均優于西比林,不亞于華佗再造丸。因此認為,對中風偏癱癥的防治,給活血祛瘀、化痰通絡的中藥方劑也是一條新的途徑。有實驗及臨床觀察證明腦缺血時腦組織LDH和CK釋放量增加,故血清LDH和CK活性測定可以作為腦缺血損傷程度的敏感指標。本實驗結果表明缺血再灌損傷腦組織血清LDH和CK活性比偽手術組顯著增高。祖國醫學認為,中風后遺癥的主要成因,一是腦缺血后,最早受到影響的是能量耗竭,導致局灶性神經原壞死;二是病理性代謝產物潴留,產生毒性作用,如興奮性氨基酸的神經毒、氧自由基、酸中毒、花生四稀酸等,損傷神經元;二者互為因果。這些病理產物的毒性稱之為“毒邪”,王永炎教授謂之為“瘀毒、熱毒、痰毒”等。中風之毒邪產生,主要是邪氣亢盛敗壞形體,即轉化為毒,毒系臟腑功能和氣血運行失常,使體內的生理和病理產物不能及時排出,蘊積體內過多而生成。中風偏癱癥主要為瘀毒、痰毒相互為患,盤踞腦絡,使腦髓失氧而產生局灶性神經功能障礙癥狀。因此,治療的根本途徑是如何盡快地清除這些有毒的病理產物。本實驗缺血再灌損傷模型組血清LDH和CK活性增高可能是痰瘀的病理產物指征,守宮水蛭組方通過活血化瘀,