核桃青皮中有害物質(zhì)的微生物種群研究

堅果是屬于桃園科的一種落葉樹，學會了核桃。我國核桃資源豐富,栽培歷史長達兩千多年,山西、河北、河南、山東、陜西、甘肅、青海及新疆南部多有栽培。目前,我國核桃種植面積達到3175萬hm2,產(chǎn)量近50萬t,種植總面積、產(chǎn)量居世界第一位。然而,核桃果實采收后,如果大量的青皮在田間、地頭或溝邊堆放,會嚴重污染生態(tài)環(huán)境,危及動植物的生存。如果對其加以利用,不僅可以防止環(huán)境污染,還可以增加果農(nóng)的經(jīng)濟收入。核桃青皮為核桃外部的一層厚厚的綠色果皮,俗稱“青龍衣”。青龍衣苦、澀、平,古代諸家多以其清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢功效入藥。現(xiàn)代研究表明,核桃青皮中每種有機化合物成分的作用各有不同,經(jīng)過溶劑浸提所得混合物可直接用于制作藥物、提取色素及制做農(nóng)藥等方面。自1985年許紹惠等首次從胡桃青皮廢棄物中分離提純出胡桃醌以來,國內(nèi)外對胡桃青皮的化學成分研究取得了一定的進展。研究顯示,胡桃果皮中化學成分有39種揮發(fā)油和7種脂肪酸,結(jié)果顯示揮發(fā)油占79.09%、脂肪酸占19.02%,其中的揮發(fā)油有烴類(26種、71.80%)、酮類(3種、10.83%)、醇類(6種、7.96%)、呋喃類(1種、5.79%)、酚類(1種、1.99%)、肟類(1種、0.95%)、酯類(1種、0.71%)七大類化合物。目前,國內(nèi)外對胡桃青皮成分以及在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等方面的研究已經(jīng)有較多的報道。但在自然條件下,核桃青皮是如何被土壤微生物分解、轉(zhuǎn)化的研究未曾見報道。本研究以核桃青皮為原料,高溫處理后讓其自然霉變,從中分離出滋生菌株,結(jié)合反證試驗獲得優(yōu)勢菌種,并通過檢測霉變前后青皮中主要營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化對該菌種的適應性等進行研究,旨在為利用木霉菌開發(fā)為生物肥料和新型生物殺菌劑提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗材料1.1.2馬鈴薯的營養(yǎng)成分濃硫酸、無水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、葡萄糖、纖維素、氫氧化鈉、石油醚(以上均為分析純)、濃磷酸、95%乙醇、考馬斯亮藍G250、蒽酮、牛血清蛋白、30%過氧化氫、瓊脂粉、馬鈴薯。真菌DNA提取試劑盒、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、100bpplusDNAladderbuffer、2×TaqPCRMasterMix、MgCl2、ITS1、ITS4、pMD18-Tvector、10×LigationBuffer、50%PEG4000、T4DNAligase、質(zhì)粒DNA提取試劑盒,均購于上海生物工程有限公司。1.1.3儀器、試劑和儀器恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)、SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責任公司)、DZF-3型真空干燥箱(上海福瑪實驗設備有限公司)、KA-1000型離心機(北京譜析通用儀器有限公司)、VIS-723N可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)、SZF-06A粗脂肪測定儀(上海新嘉電子有限公司)、DFY-5/40低溫恒溫反應浴(鞏義市予華儀器有限責任公司)、SPX-80生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)、FM-智能生化培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設備有限公司)、XH300B-微波超聲波組合合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)、LDZX-40Ⅱ-立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、SMART-生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)。1.2方法1.2.1細菌的分離、繁殖、鑒定和污染青皮處理:取核桃青皮于通風處陰干至材料發(fā)脆,放入恒溫箱內(nèi)(40-45℃)烘干,磨碎,過100目篩,裝入玻璃容器中備用。1.2.1.1.細菌的自然育種取5g核桃青皮粉于5個培養(yǎng)皿中,分別加入一定量的超純水,振蕩,至膏狀。于28℃恒溫培養(yǎng)1-4周,直至有菌發(fā)生為止。1.2.1.微生物培養(yǎng)、分離、純化取馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g,純凈水1000mL,pH自然。培養(yǎng)基經(jīng)121℃、30min滅菌。冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。挑取的微生物單菌落,移到PDA培養(yǎng)基上,于28℃生化培養(yǎng)箱中恒溫倒置培養(yǎng)5-7d,期間不斷進行菌落、菌體形態(tài)鏡檢觀察。若菌落菌體不純,混有雜菌時可將平板上長出的菌落上的孢子,用接種針挑取少許再轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),直至菌體純化為止,以便于觀察菌落、菌體形態(tài),進行分類鑒定。已純化的菌種4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.1.菌體培養(yǎng)或加蓋玻片分別用于肉眼和顯微鏡直接觀察平板上所占的菌落大小、顏色、質(zhì)地疏松程度、外觀生長狀況等。取載玻片加純水一滴(若所觀察菌體無色,則滴加染液),用接種針挑取一小塊微生物培養(yǎng)物,置于純水中,用兩支接種針將培養(yǎng)物撕成小塊,然后加蓋玻片。如有氣泡,可在酒精燈上加熱排除。此操作應在接種箱內(nèi)進行,以免孢子飛揚。顯微鏡下觀察菌體的菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)、孢子產(chǎn)生方式和排列特征等。根據(jù)菌落菌體形態(tài)觀察結(jié)果,以《真菌鑒定手冊》和《常見與常用真菌》中的描述對分離純化出的微生物進行初步鑒定。1.2.1.pcr和pcr擴增菌種總DNA提取:取培養(yǎng)5d后的菌絲,用CTAB法提取和純化基因組DNA。rDNAITS的擴增與序列測定:采用引物ITS1/ITS4進行擴增,PCR反應體系總體積25μL,反應液為:BSA2.5μL;10×PCRbuffer2.5μL,25mmol/LMgCl225μL,2.5mmol/LdNTP1.8μL,5U/μLTaq酶0.15μL,模板DNA3ng,引物ITS1和ITS4各1μL(25μmol/L),加ddH2O總體積達到12.05μL后進行擴增。擴增條件:94℃預變性3min;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10min。序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序。rDNA-ITS序列在NCBI網(wǎng)站(/Blast.cgi)中的相關序列的ITS區(qū)進行同源性比較。1.2.1.高壓蒸汽滅菌治菌膏的制備將已經(jīng)過表面滅菌的培養(yǎng)皿中分別加入5g備用的核桃青皮,加一定量的超純水,將之制成膏狀。以25g為一組放入高壓蒸汽滅菌器中,121℃、30min滅菌。將已滅菌培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,若無菌生長,則放入冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.1.6.懸掛式擴散劑將分離純化得到的各菌株編號,然后分別接種在液體培養(yǎng)基中,28℃恒溫培養(yǎng)24h。1.2.1.菌株制備及培養(yǎng)將制備的菌懸液污染無菌核桃青皮培養(yǎng)基,每菌株制作6組,并設一對照組,之后,置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)原接種的菌株。1.2.2綠色皮膚基質(zhì)化學成分的測定1.2.2.核桃青皮提取物含量測定標準曲線的配制:蒽酮試劑(2g蒽酮溶于1000mL體積分數(shù)為80%的硫酸中,當日配制使用),標準葡萄糖溶液(0.1mg/mL)(表1),沸水浴中煮沸10min,取出,自來水冷卻,室溫放置10min,620nm處比色。樣液的制備:稱取備用核桃青皮2g加入蒸餾水50mL超聲波微波輔助提取,溫度80℃,微波功率400W,提取時間9min(間歇處理:處理3min,冷卻3min),然后,將樣液經(jīng)4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min,取上清液抽濾,將濾液定容至100mL,備用。樣品含量的測定:精密量取4mL供試溶液5份,分別置于25mL容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻。分別精密量取上述溶液1mL于具塞試管中,置于冰水浴中5min,并分別加入蒽酮試劑4mL,然后在沸水浴中加熱10min,之后用自來水冷卻。以蒸餾水加蒽酮試劑為對照,在波長620nm處測定吸光度。按標準曲線方程計算樣品中糖的含量。1.2.2.石油醚的提取將洗凈的抽提瓶用鉛筆在磨口處編號,103-105℃烘2h,取出后置于干燥器內(nèi)冷卻、稱重,并記為A。取1kg核桃青皮103-105℃烘2h,取出后置于干燥器內(nèi)冷卻備用。稱取干樣1g,裝入事先準備的濾紙包中,脫脂棉線包好,置于抽提器底部。在抽提瓶內(nèi)加入石油醚,恒溫水浴加熱回流8h。水浴溫度控制在70-80℃(以120-150滴/min為宜)。提取完畢,收集石油醚,置103-105℃烘箱中烘30min,冷卻至室溫,稱重,并記為B。由抽提瓶增加之重量計算樣品的脂肪含量。1.2.2.樣液的制備及含量測定標準曲線的繪制:0.9%NaCl溶液,標準蛋白液(0.1mg/mL牛血清蛋白),考馬斯亮藍G250(0.01%)(表2),搖勻,室溫靜置3min,于波長595nm處比色。樣液的制備:稱取備用核桃青皮干燥樣品0.5g加少量石英砂用0.9%NaCl溶液研磨成勻漿定容至100mL,靜置10-30min(3-5min搖動1次)后過濾(加活性炭脫色),濾液定容至100mL備用。樣品含量的測定:分別精密量取1mL供試溶液及4.0mL考馬斯亮藍染液于5支試管中,搖勻,室溫靜置3min,于波長595nm處測定吸光度。按標準曲線方程計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。1.2.2.u3000纖維素在濾渣、織物上的安裝標準曲線的繪制:0.1mg/mL纖維素標準液,2%蒽酮,濃硫酸(表3),搖勻,靜置12min,620nm處比色。核桃青皮纖維素獲取:精確稱取5g核桃青皮粉于磨口錐形瓶中,按料液比1ue73b20(m/V)加入已調(diào)至pH1.5的蒸餾水,置85℃的水浴鍋中不斷攪拌,提取2.5h,2層紗布抽濾,濾渣用pH1.5的蒸餾水洗滌3次,保留濾渣。將濾渣按料液比1ue73b20浸于6%的氫氧化鈉中,室溫條件下放置20h,適當攪拌。將浸泡過的物料過濾,濾渣洗至中性。然后加等量10%過氧化氫溶液并用50%乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-5.0,30℃恒溫放置30min,冷卻至室溫過濾。將所得濾渣水洗至中性,再用50%酒精洗滌,60℃干燥,得纖維素。樣液的制備:準確稱取纖維素0.2g于燒杯中,置于冷水浴中,加入60%H2SO4溶60mL,并消化30min,然后將消化好的纖維素溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶,用60%H2SO4定容至刻度,搖勻后用布氏漏斗過濾。樣液的測定:取上述濾液5mL放入100mL容量瓶中,在冷水浴上加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻后使用。分別精確量取溶液2mL于5支具塞試管中,再分別加0.5mL2%蒽酮試劑,并沿試管壁加5mL濃H2SO4,塞上塞子,搖勻靜置12min,然后在620nm波長下測吸光度,按標準曲線方程計算樣品中纖維素的含量。2結(jié)果2.1htqp-2、htqp-4從核桃青皮中分離純化得到4株菌株,分別編號為HTQP-1、HTQP-2、HTQP-3、HTQP-4。4株菌株的共同特征是菌落干燥、大而疏松或大而致密、不透明,菌落顏色各不相同,在PDA培養(yǎng)基上菌落正反面顏色不同,細胞生長速度較快。2.1.1堅果粉微生物的形態(tài)特征核桃青皮微生物的分離純化后,將其菌種保存于PDA培養(yǎng)基,并對菌株的菌落形態(tài)和顯微結(jié)構的觀察和記錄(表4,圖1)。2.1.2不同種類霉的htqp-1、htqp-4、htqp-4根據(jù)菌株培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及ITS基因序列同源性對比等進行綜合分析,參考有關資料認為HTQP-1為黃曲霉,HTQP-2為青霉,HTQP-3為黑曲霉,HTQP-4為木霉。具體情況見表5。2.1.3不同菌株在青皮培養(yǎng)基上的生長情況將上述4株菌株進行微生物反證試驗,結(jié)果(表6)顯示。黃曲霉(HTQP-1)、青梅(HTQP-2)、黑曲霉(HTQP-3)和木霉(HTQP-4)菌株均在青皮培養(yǎng)基上出現(xiàn),說明這4株菌株不是污染性的雜菌,但每種菌株出現(xiàn)時間和生長速度差異明顯。結(jié)合它們在青皮培養(yǎng)基上的生長狀況,可判斷木霉(HTQP-4)是核桃青皮微生物中的優(yōu)勢菌種(圖2)。2.1.4制備綠色藥物木霉菌在核桃青皮培養(yǎng)基上生長迅速,4d后有一般菌絲轉(zhuǎn)綠,6d后全部菌絲轉(zhuǎn)綠,布滿培養(yǎng)皿,菌絲末端產(chǎn)生大量的綠色孢子(圖3)。本次培養(yǎng)的木霉菌純度,長勢都較好,便于常規(guī)方法進行擴繁及保存。2.2綠色飼料優(yōu)勢培養(yǎng)的營養(yǎng)成分的測定2.2.1結(jié)果表1葡萄糖標準曲線如圖4所示;樣品可溶性總糖含量測定結(jié)果見表7;試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基總糖濃度的差值平均值為0.1930mg/mL,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基總糖含量差值(H)為6.03%。2.2.2青皮培養(yǎng)基脂肪含量樣品脂肪含量測定結(jié)果(表8)顯示,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基脂肪含量差值平均值為0.0297mg/mL,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基脂肪含量差值(H)為2.97%。2.2.3培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)標準曲線如圖5所示;樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果(表9)表明,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量差值平均值為0.3840mg/mL,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量差值(H)為7.68%。2.2.4青皮培養(yǎng)基纖維素含量纖維素標準曲線如圖6所示;樣品纖維素含量測定結(jié)果(表10)表明,試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基纖維素濃度差值平均值為0.0647mg/mL,所以試驗前后核桃青皮培養(yǎng)基纖維素含量差值(H)為64.7%。3核桃青皮工程模擬根據(jù)菌株培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及ITS基因序列同源性對比等進行綜合分析,參考有關資料認為,HTQP-1為黃曲霉、HTQP-2為青霉、HTQP-3為黑曲霉和HTQP-4為木霉,利用反證試驗法證實木霉(HTQP-4)是核桃青皮微生物中的優(yōu)勢菌種。目前對微生物的生物學鑒定主要依據(jù)各分類單位在分化特征和形態(tài)特征上的異同點。但同一屬不同種的形態(tài)往往又極其相似,難以區(qū)分。不同的用途要求對菌種需要精確的分類和鑒定,傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法很難適用于此。近年來研究工作者廣泛運用包括等位酶技術、RAPD、AFLP、UP-PCR、DNA指紋和序列分析技術在內(nèi)的分子生物學方法,通過比較菌株間DNA序列的相似性程度,可對微生物的種進行精確歸類和分析。培養(yǎng)前后核桃青皮可溶性糖、脂肪、蛋白質(zhì)和纖維素含量分別減少6.03%、2.97%、7.68%和64.7%,與4種菌種存在密切的關系。根據(jù)培養(yǎng)前后核桃青皮有機物質(zhì)變化情