高效液相色譜法測定葉木草素的含量

黃酮類化合物廣泛分布于植物邊界，主要存在于植物果實(shí)、種子、花和葉中。它們是具有抗逆、抗腫瘤、抗過敏等多種生物活性的多酚類化合物。木樨草素有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降低兔實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化程度和降膽固醇等作用。竹葉黃酮相對其他植物提取具有明顯的優(yōu)勢,安全無毒,同時竹葉提取物良好的工藝特性使得竹葉黃酮的應(yīng)用前景更為廣闊。竹葉提取物中總黃酮含量測定的方法報道很多,但關(guān)于竹葉提取物中木樨草素含量的測定報道很少,筆者以期建立高效液相色譜測定竹葉提取物中木樨草素含量的方法,為竹葉提取物中木樨草素含量的測定提供更簡便有效的方法。1材料和方法1.1設(shè)備Waters2695-2487高效液相色譜儀;SartoriusBP221S分析天平;超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。1.2黃酮提取物木樨草素對照品購于杭州天草生物科技有限公司,竹葉黃酮提取物購于浙江安吉圣氏生物制品有限公司和金華貝康生物制品有限公司。甲醇和乙腈均為色譜純,水為超純水,其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.3測試方法1.3.1對照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取1.7mg木樨草素標(biāo)準(zhǔn)品,置于10ml容量瓶中,加入甲醇超聲溶解并定容至10ml,搖勻即得0.17μg/L的木樨草素對照品溶液。準(zhǔn)確移取0.1、0.3、0.5、0.7和1.0ml對照品溶液至2ml容量瓶中,用甲醇定容,備用。1.3.2樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取40.0mg竹葉黃酮提取物,置于250ml容量瓶中,用甲醇超聲溶解并定容至250ml,過0.45μm濾膜,待測。1.3.3添加可重復(fù)試驗(yàn)將竹葉提取物用甲醇溶解后,取3份相同的樣品,加入3種不同濃度的木樨草素對照品溶液,每個濃度作5個平行。1.3.4梯度曲線及流動相梯度色譜柱為YMC-ODS-A,流動相A為乙腈,B為0.5%磷酸緩沖液,采用梯度洗脫,梯度曲線(curve)、流動相梯度程序見表1,檢測波長為335nm,流速為1.0ml/min,柱溫為25℃,進(jìn)樣量為10μl,木樨草素的保留時間在38min。2結(jié)果與分析2.1色譜穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取木樨草素標(biāo)準(zhǔn)品和黃酮提取物樣品溶液10μl,按照上述的色譜條件進(jìn)樣,得到木樨草素的保留時間在38min左右,樣品在38min也有明顯的峰,試驗(yàn)結(jié)果說明色譜系統(tǒng)具有良好的適應(yīng)性和專屬性。如圖1、2所示。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取上述配好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μl進(jìn)樣,以木樨草素進(jìn)樣量x為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=36303x-3635.2,R2=0.9996。結(jié)果表明木樨草素在0.2～14.0mg/ml與峰面積具有良好的線性關(guān)系。2.3準(zhǔn)確度的研究取同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μl連續(xù)進(jìn)樣6次,測得峰面積的RSD為0.36%,表明儀器精密度良好。2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品10μl在0、1、2、6、8h進(jìn)樣,在0～6h測定木樨草素峰面積RSD為0.90%,表明樣品在6h內(nèi)比較穩(wěn)定。2.5加樣回收率和rsd取同一竹葉黃酮提取物3份,加入3種濃度的對照品溶液,按照上述色譜條件進(jìn)樣,得到平均回收率為112.74%,RSD為2.45%。結(jié)果見表2。2.6草素的含量根據(jù)上述檢測條件進(jìn)樣測得樣品的濃度:浙江安吉圣氏生物制品有限公司產(chǎn)品的木樨草素含量為1.9575mg/g,金華貝康生物制品有限公司產(chǎn)品的木樨草素含量為1.6350mg/g。3流動相法分離目前有關(guān)竹葉提取物中總黃酮的測定已有大量的報道,但僅測定竹葉提取物中木樨草素的文獻(xiàn)少見。筆者利用高效液相色譜建立了測定竹葉提取物中木樨草素含量的方法,該方法較簡單、方便。張晶等采用高效液相色譜法測定木樨草素含量時,流動相配比是固定的。竹葉提取物中主要的活性成分為黃酮類物質(zhì),且種類較多。木樨草素是黃酮類物質(zhì)的一種,由于性質(zhì)相似,在固定流動相的情況下,竹葉提取物中的黃酮類物質(zhì)包括木樨草素在分離檢測過程中很難獲得很好的分離,該試驗(yàn)采用梯度洗脫,取得了很好的分離效果,為進(jìn)一步分離檢