甜葉菊多倍體誘導及鑒定

杏仁是富含甜菊醇糖苷（gs）的半濕潤亞熱帶植物。甜菊醇糖苷作為一種新型的甜味劑,具有高甜度(甜度是蔗糖的300~400倍)、低熱量、無毒等特點,已被作為天然的非營養型甜味劑替代糖精在食品、醫藥、釀造、化妝品、飼料等生產領域應用(Madanetal.,2010;Yadavetal.,2011)。甜葉菊葉中富集了占干重10%以上的糖苷類物質,目前已鑒定到的9種主要甜菊醇糖苷成分中,甜菊糖苷(stevioside,S)和萊寶迪苷(rebaudioside,R)A占干葉比重最高,也是目前應用最為廣泛的甜葉菊糖苷成分(Wolwer-Rieck,2012)。隨著人們對健康的崇尚,聯合國糧農組織和世界衛生組織聯合食品添加劑專家委員會(JECFA)第73次會議批準純度不低于95%的甜菊醇糖苷可作為甜味劑使用(Tadaetal.,2013)。因此,提高甜葉菊中甜菊醇糖苷的含量,是育種工作者迫切需要解決的問題。多倍化是促進植物發生進化的重要力量,多倍體植株由于染色體的加倍,其根、莖、葉、花、果實等多表現出增大、活性成分含量提高,植株抗逆性增強等顯著特征(MasonandBatley,2015)。如四倍體金銀花“九豐一號”二倍體增產58.7%(國信,2005);何首烏多倍體表現為塊根重顯著提高,營養優勢明顯優于二倍體,在單株塊根有效成分二苯乙烯苷的產量方面,與四倍體(二苯乙烯苷的產量是二倍體的1.69倍)相比,三倍體(二苯乙烯苷的產量是二倍體的2.99倍)在塊根產量及二苯乙烯苷產量方面更具優勢(汪珍春等,2012)。可見,可通過多倍體育種方法,實現高含量甜菊糖苷和萊寶迪苷A甜葉菊新品種的選育。本研究以甜葉菊種子為材料,研究甜葉菊多倍體誘導方法,以期為高生物量的甜葉菊種質資源創新提供供選材料。1結果與分析1.1多聚糖對多hd的誘導效果用不同濃度秋水仙素處理甜葉菊萌動種子不同時間,誘導率不同(表1)。用含有2%DMSO的0.1%秋水仙素處理萌動種子1d,誘導率最高為20%,處理2d,萌動種子不生根;用含有2%DMSO的0.05%秋水仙素處理萌動種子1d,無多倍體獲得,處理2d,誘導率僅為10%。1.2甜葉菊染色體核型觀察取對照及秋水仙素處理組植株根尖進行壓片觀察拍照,二倍體甜葉菊染色體數目為2n=22,多倍體的染色體數目為2n=44,即為四倍體(圖1)。1.3dna含量檢測流式細胞儀分析研究表明(圖2),以二倍體植株DNA含量為參考,多倍體植株的DNA含量峰值位于400道的位置,說明多倍體植株細胞核DNA含量為二倍體的2倍,判斷該多倍體植株為四倍體。1.4氣孔長度和氣孔密度觀察經過觀察對比多倍體與對照二倍體的氣孔大小和密度,發現多倍體的氣孔長度顯著大于對照二倍體(p<0.05),氣孔寬度與對照二倍體無顯著差異;相同觀察視野下,多倍體氣孔密度顯著小于對照二倍體(p<0.05)(圖3;表2)。1.5花瓣花鏡觀察與二倍體同等培養條件下,對四倍體植株的株型,葉片大小,花蕾,花朵大小進行觀察。四倍體植株,葉片增大,花蕾數目減少,花朵增大。經扦插后,四倍體莖段扦插成活率(95%)高于二倍體(80%)(圖4)。2離體誘導法ds甜葉菊多倍體育種方法在國內已有一些報道,但都是結合甜葉菊組織培養方法,采用離體組織培養技術進行多倍體的誘導。王波等(2011)將甜葉菊離體莖段側芽作為外植體,在離體莖段生長過程中,用不同濃度的秋水仙素對離體莖段進行不同時間處理,實驗表明,當秋水仙素濃度為0.1%,處理時間為3d時,多倍體誘導率最高為42.3%,且再生植株數目最多,但容易獲得嵌合體。李紅等(2012)以0.2%濃度的秋水仙素對甜葉菊不定芽進行12h浸泡處理,四倍體誘導率達32.14%,但嵌合體獲得率為35.71%。彭程等(2014)采用0.025%秋水仙素持續處理甜葉菊試管苗莖段再生苗,也獲得了較多的甜葉菊多倍體,但需多次選拔接種培養,耗時較長。雖然離體誘導法可以高效率地誘導甜葉菊多倍體的產生,但容易獲得嵌合體(周慧文等,2015),而且實驗操作過程中需要對植物材料進行消毒處理獲得無菌外植體,更換培養基等環節,既浪費人力物力又易造成培養材料的污染等問題。本實驗以甜葉菊種子為材料,用秋水仙素處理萌動種子,經流式細胞儀鑒定植株倍性,誘導率可達20%,利用此方法不僅可以縮短實驗周期,而且以甜葉菊種子為實驗材料,材料易獲得,操作簡便,利于大批處理,從而有效提高甜葉菊多倍體的獲得效率。3材料和方法3.1試驗材料供試材料為2014年收獲的甜葉菊中山二號種子,秋水仙素購自東京化成工業株式會社。3.2不同處理的秋水仙素對dmso的誘導效果蒸餾水浸泡甜葉菊種子,選取萌動種子分別用含有2%DMSO的0.1%秋水仙素和0.05%秋水仙素避光處理不同時間后(表1),水洗,播種(誘導率=多倍體植株數量/誘導處理種子數量)。3.3苯酚染色,合成鏡檢取出苗4周的植株根尖置于4℃蒸餾水中冷處理24h,1mol/LHCl60℃水解10min,改良苯酚品紅染色,壓片,鏡檢拍照(德國Leica,DM2500)。3.4raki染色液制備DNA相對含量的測定以植株第一對幼葉為材料,加入400μLNucleiExtractionBuffer(Partec,CyS-tainUVPreciseP05-5002),吉利刀片迅速切碎,過濾,加入1600μLDAPI染色液后立即上機檢測(德國Partec,CyFlowCube8)。3.5孔密度和保護細胞大小的測量取與對照相同葉