細胞傳代、鋪板、凍存、復蘇等細胞培養相關2020年9月16日細胞污染鋪板不勻密度不合適

問題：狀態不佳1.細胞傳代3.細胞鋪板4.細胞凍存5.細胞復蘇目錄細胞傳代原因及概念：培養的細胞由于細胞增殖，密度過大，出現接觸抑制，導致細胞難以繼續生長繁殖，甚至死亡，需要進行分瓶培養，將培養的細胞分散，以一定的比例轉移到另外的容器中進行培養，即為細胞傳代。細胞傳代的步驟（貼壁細胞為例）首先，鏡下觀察細胞密度，90%以上即可傳代培養（為了細胞的穩定，距離上一次傳代至少間隔一天。）。準備工作：無菌槍頭、培養瓶、離心管、廢液桶等所需物品，培養基、血清、PBS、胰酶等試劑類，可根據情況，提前放入生物安全柜，進行紫外滅菌；細胞傳代的步驟（貼壁細胞為例）把細胞轉移到生物安全柜中，吸去培養基，加入無菌PBS（只要沒過即可），輕輕搖動清洗細胞，盡量棄盡PBS。加入1ml胰酶細胞消化液，放入培養箱，并計時，不確定消化時間的，需隨時鏡下觀察，待細胞從完全鋪展開的貼壁狀態，變成即將懸浮的小亮點時，為最佳。迅速移至生物安全柜，加入等體積的完全培養基，終止消化，全面輕柔吹打，轉移細胞懸液至無菌離心管中，離心1000轉，3-5min。準備新的培養瓶，加入新鮮的完全培養基4-6ml。離心完畢，輕輕倒掉，加入完全培養基，輕柔吹散，吸取500ul細胞懸液加入培養瓶，輕輕搖動，混勻，放入培養箱。細胞處理過程一切無菌操作均需在生物安全柜中進行

無菌培養基、PBS、試劑等；無菌離心管、培養板、培養瓶、培養

皿、槍頭等，在生物安全柜中方能打開。手消毒：75%乙醇/酒精棉球隨時消毒。細胞操作過程中，及時蓋上蓋子（培養皿/板、離心管、培養基等）。操作時，手部和胳膊不要從已開蓋的無菌細胞、培養基等上方略過。培養基、PBS、血清等分裝使用。無菌試劑、槍頭、廢液桶等提前擺放得當，以便于操作。X?細胞鋪板常規的細胞傳代步驟，至細胞消化后離心完畢，用適量的完全培養基重懸細胞。根據需要鋪板的數量，用無菌離心管或者培養瓶，配制完全培養基（可多配1-2ml）。吸取適量的細胞懸液，加入到配制的完全培養基中，吹打使充分混勻，立即等量加入到培養板的每個孔中。充分搖勻后，輕輕轉移入細胞培養箱中。培養器皿面積（cm2）培養液量（ml）100%細胞量（105）（約）96孔板0.320.1148孔板0.950.22.524孔板1.910.5512孔板3.831106孔板9.52253.5cm培養皿9.62206cm培養皿21.355210cm培養皿58.11013725cm培養皿2555075cm培養皿7515-30200培養板需要加入培養基的體積以及細胞數量各種規格細胞培養板需要加入的培養基的體積，可以參考下表。細胞培養板中加入細胞的數量，需要考慮一下幾點：1.

常規實驗的設計：轉染siRNA（約30%-50%），轉染質粒（約70%-80%），還要綜合考慮轉染試劑對細胞密度的要求等。2.細胞生長的速度，細胞的大小，細胞處理的時間長度（24h，48h...）。3.根據后續相應檢測試劑盒的要求（CCK-8,細胞周期，流式，熒光染色等）。培養板需要加入的細胞量培養板中細胞數量的控制：1.按照經驗：一個培養瓶100%滿后，大概可鋪n個6孔板（2n個12孔板...）等,結合鏡下觀察，調整濃度。2.

計數細胞：參考前文中各種規格中100%滿時細胞的大概數量，再根據實驗的要求，計算加入的細胞的數量。（使用計數板）干凈的蓋玻片0.1ul細胞計數板的使用細胞計數板細胞計數板的使用計算公式：n/4x104

（個/ml）注意:避免有氣泡！10-20ul細胞懸液數上不數下，數左不數右計數板中每一方格的面積為0.01cm2，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001cm3，即0.1mm3。由于1ml=1000mm3，所以每一大方格內細胞數×10000=細胞數/ml，故可按下式計算：細胞懸液細胞數/mL=4個大格細胞總數/4×10000。細胞鋪板均勻的注意事項1.細胞消化離心后，盡量在離心管中吹打均勻后，迅速加入到培養板中。2.最好每加完一個培養板后，吹打混勻一次，再加入到下一個培養板中（對于96孔板，每加三到四行/列后，吹打混勻一次）。3.細胞加入到培養板中后，在操作臺上，沿大8字輕輕搖勻，靜置數分鐘，或者立即平行轉移到細胞培養箱中，在此過程中，切記不可晃動培養板，不可撞擊等劇烈動作。4.其他：輕輕移動他人的細胞，輕輕關閉培養箱的門等細胞凍存準備工作：FBS，完全培養基，DMSO，或無血清凍存液，凍存管，凍存盒。常規的細胞傳代步驟，至細胞消化后離心完畢，根據細胞的量以及需要凍存的管數配制凍存液；凍存液：10%DMSO+90%FBS/完全培養基（A），或者無血清凍存液（B）。凍存程序：A

：1.使用凍存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天轉移入液氮罐中。

2.不使用凍存盒：需要梯度降溫，4℃（30min-1h），-20℃（30min），-80℃

過夜，第二天轉移入液氮罐中。

B

：使用無血清凍存液：可直接放入-80℃，可長期保存于-80℃冰箱。細胞復蘇提前打開水浴鍋，設置溫度37℃。從冰箱取出完全培養基，置于室溫復溫。依次把培養瓶/皿、槍頭盒、離心管，置于生物安全柜中，紫外照射15-30min。待紫外結束，首先，在培養瓶/皿中，加入適量的完全培養基，并做好標記。從液氮罐或者負80冰箱，迅速取出凍存細胞，轉移入37℃水浴鍋，使其迅速解凍（1min之內）。解凍后，