雷公藤紅素納米混懸劑的制備及抗腫瘤作用研究

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，70%左右的候選人藥物在制劑開(kāi)發(fā)階段被溶解和生物利用低。雷公藤紅素（celastrol,Cel），又名南蛇藤素，1936年由趙承瑕首次從傳統(tǒng)中藥雷公藤的根部分離得到，是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物（化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)近些年來(lái)研究者已通過(guò)制劑手段來(lái)提高Cel的溶解度和生物利用度，降低毒性。如陳欣妍等1儀器、試藥與培養(yǎng)基ZetasizerNanoZS型粒度儀，英國(guó)MalvernInstruments公司；MettlerToledoAL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，北京恒豐長(zhǎng)偉科技有限公司；DX-2700型X射線衍射儀，上海精密儀器儀表有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安有限公司；Biotek酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子珠式會(huì)社；TecanInfiniteM1000PRO多功能酶標(biāo)儀，力臻卓越（北京）科學(xué)儀器有限公司。Cel，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，成都阿克丁公司，批號(hào)CE-180402；泊洛沙姆188(P-188），中國(guó)西格瑪有限公司，批號(hào)018K0029；色譜乙腈，賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)192855；無(wú)水乙醇，分析純，北京化工廠，批號(hào)20190118；氧化鋯球，直徑為0.4～0.6mm，長(zhǎng)沙華尊陶瓷材料有限公司；二甲基亞砜（DMSO），分析純，北京化工廠。小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人皮膚惡性黑色素瘤SK-MEL-28細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞均購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)AD15805337、AD17218271；胎牛血清（批號(hào)2017488）、0.25%Trypsin-EDTA(1×），美國(guó)Gibco公司；青霉素和鏈霉素雙抗，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)20170417。2方法和結(jié)果2.1cel-nsp是用微結(jié)合的方法制備的參照文獻(xiàn)方法2.2飽和和藥物晶體的制備沉淀法是基于“bottom-up”原理制備N(xiāo)Sps的常用技術(shù)，該法通過(guò)將藥物的良溶劑加入到可互溶的不良溶劑中，藥物因過(guò)飽和而析出形成納米尺寸的藥物晶體，最后除去有機(jī)溶劑。具體操作如下：精密稱取8mgCel溶于0.8mL無(wú)水乙醇中，再稱取1mgP188溶于8mL去離子水中，在超聲（25℃，250W）條件下將藥物的醇溶液緩慢滴入到水相中，45℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得CelNSps，記為Cel-NSps(b)。2.3樣品測(cè)定和zeta電位分別取上述2種方法制備的Cel-NSps適量，適當(dāng)稀釋后用馬爾文激光粒度儀測(cè)定其平均粒徑、PDI及Zeta電位，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)圖2。Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)的平均粒徑分別為（215.7±0.7）、（133.1±0.8)nm,PDI分別為0.17±0.02、0.13±0.02,Zeta電位分別為（-18.0±0.6）、（-16.9±1.2)mV。2.4cel-nsps的電鏡觀察將上述2種方法制備的Cel-NSps稀釋到100μg/mL，取6.0μL滴到300目銅網(wǎng)上，靜置5min后用濾紙吸干多余液體，室溫放置20min后，滴加6.0μL2%磷鎢酸負(fù)染色液于銅網(wǎng)上，自然晾干，使用JEM-1400透射電子顯微鏡（TEM）觀察Cel-NSps的形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3。微型化介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)呈無(wú)規(guī)則形狀，而沉淀法制備的Cel-NSps(b)呈球形，在TEM下2種納米粒的粒徑均小于動(dòng)態(tài)光散射法（DLS）測(cè)得的粒徑，這是因?yàn)門(mén)EM觀測(cè)的是干燥粒子的粒徑，而DLS觀測(cè)的是水化粒子的粒徑2.5sps法xrd采用真空冷凍干燥機(jī)將上述2種Cel-NSps凍干成粉末，然后與原料藥（Cel）、穩(wěn)定劑（P188）、Cel與P188的物理混合物（8∶1）一起進(jìn)行XRD分析2.6密封放置穩(wěn)定性研究將微量介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)和沉淀法制備的Cel-NSps(b)密封放置于4℃，分別在0、2、4、8、15、23、30d時(shí)取樣測(cè)粒徑，結(jié)果見(jiàn)表1,4℃放置30d納米粒粒徑無(wú)明顯變化，且無(wú)肉眼可見(jiàn)的聚集和沉淀現(xiàn)象，說(shuō)明2種方法制備的Cel-NSps在4℃下能穩(wěn)定存在30d。2.7介質(zhì)的穩(wěn)定性研究2.7.1cel-nsps在生理介質(zhì)中的粒徑變化2.7.2研磨法制備的納米粒中cel的剩余量將Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分別與1.8%NaCl、10%Glu和PBS(2×）溶液等體積混合；與人工胃腸液、大鼠血漿按體積比1∶4混合，37℃孵育，并分別于0、2、4、6、8h取樣100μL，用900μL色譜甲醇充分混勻后渦旋10min,HPLC測(cè)定Cel質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算Cel剩余量，剩余量=C從圖5可以看出，研磨法制備的納米粒中Cel在5%Glu、PBS和人工腸液中孵育8h后藥物剩余量大于90%；而在0.9%NaCl、人工胃液和血漿中孵育8h后藥物剩余量最低降到81%，推測(cè)和該納米粒在0.9%NaCl中粒徑增大、腸液低pH值以及胃蛋白酶和血漿中蛋白類(lèi)成分和代謝酶有關(guān)。沉淀法制備的納米粒中Cel在0.9%NaCl、5%Glu、PBS、人工胃液和人工腸液中孵育8h后剩余量大于90%；在血漿中剩余量降到84%，可能是受血漿中蛋白類(lèi)成分和代謝酶影響。2.8cel-nsps的載劑量測(cè)量2.8.1條件1色譜柱為VenusilMPC2.8.2樣品制備及色譜條件考察精密稱取一定量的Cel對(duì)照品，用色譜甲醇溶解，按“2.8.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，觀察峰形、對(duì)稱性及有無(wú)雜質(zhì)峰干擾。同時(shí)，按照“2.2”項(xiàng)方法制備Cel-NSps和不含藥的空白NSps，用色譜甲醇稀釋后按照上述色譜條件進(jìn)樣，并記錄相應(yīng)色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。Cel的保留時(shí)間為14.3min，峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾；空白納米粒在14.3min未出峰，說(shuō)明輔料對(duì)Cel的檢測(cè)沒(méi)有干擾，專屬性良好。2.8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建參照文獻(xiàn)方法2.8.4進(jìn)樣和進(jìn)樣的確定取“2.8.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為5、50、100μg/mL的Cel溶液于1d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)精密度；日間連續(xù)進(jìn)樣5d，考察日間精密度。結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度的RSD值均小于5%，表明此方法的精密度良好，符合含量測(cè)定的要求。2.9外部釋放研究采用透析袋擴(kuò)散法考察Cel-NSps的體外釋放情況2.10外細(xì)胞毒性試驗(yàn)將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的4T1、HepG2、SK-MEL-28和MCF-7細(xì)胞以每孔8×103不同藥物中cel-nsps的體外釋放比較微型介質(zhì)研磨法是對(duì)傳統(tǒng)介質(zhì)研磨法的改良，所需原料藥較少，更適合前期在實(shí)驗(yàn)室的制劑處方及工藝研究。此外，該方法可以大大提高藥物的活性，操作簡(jiǎn)單，工藝穩(wěn)定，且無(wú)需使用有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)溶劑殘留造成的環(huán)境污染和機(jī)體毒性，但是該方法制備的納米粒穩(wěn)定性較差藥物晶型可能影響藥物的釋放、藥效和安全性，研究者應(yīng)關(guān)注制備過(guò)程中藥物晶型的改變，一般來(lái)說(shuō)介質(zhì)研磨法可以保持藥物原有的晶型，而沉淀法容易造成藥物晶型的轉(zhuǎn)變2種方法制備的Cel-NSps，藥物、輔料、藥載比都相同，因制備方法不同，導(dǎo)致納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑變化和藥物在納米粒中的存在形式不同。難溶性藥物的納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑，有時(shí)和在純水中相近，有時(shí)會(huì)比在純水中略大，有時(shí)粒徑會(huì)增大很多甚至出現(xiàn)聚集沉淀。這種變化與藥物本身的性質(zhì)、輔料性質(zhì)、納米組裝方式，納米粒的電位、水化層和表面性質(zhì)，以及生理介質(zhì)的離子強(qiáng)度都有關(guān)系，迄今尚無(wú)形成一套理論能夠解釋不同藥物不同輔料的納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑變化。介質(zhì)研磨法制備的納米粒粒徑偏大，在人工胃液中粒徑增大較多；沉淀法制備的納米粒粒徑較小，在各種不同介質(zhì)中均較穩(wěn)定。這可能是由于沉淀法制備的納米粒呈球形，制備過(guò)程中穩(wěn)定劑P188能更加均勻地覆蓋在納米粒表面；而研磨法制備的納米粒形狀不規(guī)則，穩(wěn)定劑吸附不如沉淀法。介質(zhì)研磨法通常不改變藥物的晶型，Cel依然是以結(jié)晶狀態(tài)存在；而反溶劑沉淀法的制備過(guò)程中，藥物溶解成小分子后再自組裝成納米大小的顆粒，有時(shí)會(huì)保持原來(lái)的結(jié)晶形式，有時(shí)會(huì)形成能量更高的無(wú)定形態(tài)，而本研究中，Cel用反溶劑沉淀法制備的納米粒為無(wú)定形狀態(tài)。藥物存在形式的不同，導(dǎo)致體外釋放上的不同。在完全相同的條件下，微量介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)，在144h內(nèi)呈勻速、平穩(wěn)、緩慢的釋放；而反溶劑沉淀法制備的Cel-NSps(b)，因無(wú)定形態(tài)處于亞穩(wěn)定的高能狀態(tài)，故先經(jīng)歷1個(gè)為期48h的快速釋放相，然后是接近坪值的非常緩慢的慢釋放相。但2種納米粒的體外累積釋放都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)Ce的物理混懸液。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)為下一步體內(nèi)藥效考察建立動(dòng)物模型提供了參考依據(jù)，從MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，Cel納米粒對(duì)4種細(xì)胞的IC綜上所述，本研究通過(guò)微型介質(zhì)研磨法和反溶劑沉淀法制備了粒徑小、穩(wěn)定性好、載藥量高、可用于口服或靜脈注射的Cel-NSps，且制備方法簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化大生產(chǎn)，有望成為繼紫杉醇之后的新一代天然抗腫瘤藥物將Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分別與1.8%NaCl、10%Glu和磷酸鹽緩沖液（PBS)(2×）溶液等體積混合；與人工胃腸液、大鼠血漿按體積比1∶4混合，37℃孵育，并分別在0、2、4、6、8h取樣測(cè)粒徑，觀察有無(wú)聚集、沉淀，結(jié)果見(jiàn)圖5。與上述生理介質(zhì)共孵育8h后，Cel-NSps(a)在PBS溶液中粒徑變化較小，且無(wú)任何渾濁、沉淀現(xiàn)象，說(shuō)明CelNSps(a)在PBS中穩(wěn)定性較好，而在0.9%NaCl、5%Glu和人工腸液中，Cel-NSps(a)的粒徑有增大趨勢(shì)，但是無(wú)沉淀現(xiàn)象，說(shuō)明Cel-NSps(a)在這3種介質(zhì)中穩(wěn)定性一般，而在人工胃液中Cel-NSps(a)粒徑由215nm增大到919nm，說(shuō)明Cel-NSps(a)在人工胃液中不能穩(wěn)定存在，可