〔1〕高級生化復習題酶的催化混雜性(Enzymepromiscuity〕：是指酶具有能催化除其自然反響外的其它反響的力量,也就是說在單個位點催化不止一類化學反響的力量混亂性。活性中心的催化三聯體：催化三聯體通常指在水解酶和轉移酶的活性位點中心同時作用的三個氨基酸殘基〔如蛋白酶、酰胺酶、酯酶、酰基轉移酶、脂肪酶和β-內酰胺酶〕。用于共價催化的親核殘基一般是酸-堿-親核三聯體。聚合酶鏈式反響：簡稱PCR。聚合酶鏈反響〔PCR〕是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火〔復性〕及適溫延長等幾步反響組成一個周期，循環進展，使目的DNA得以快速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。比較基因組學〔ComparativeGenomics〕：在基因組圖譜和序列分析的根底上，對基因和基因的構造進展比較，了解基因的功能，表達調控機制和物種進化過程的學科。酶的轉化數〔Kcat〕：在單位時間內每一活性中心或每分子酶所能轉換的底物分子數。Toll樣受體〔Toll-likereceptors〕：是參與非特異性免疫〔自然免疫〕的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR是單個的跨膜非催化性蛋白質，可以識別來源于微生物的具有保守構造的分子。當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時，TLR鳥槍測序法〔wholegenomeshotgun〕：一種分析大片段基因組DNA序列的策略，主要是指將大片段DNA隨機切成很多1～1.5kb的小片段，分別對其測序，然后借助序列重疊區域拼接成全段序列。蛋白質芯片：一種高通量的蛋白功能分析技術，可用于蛋白質表達譜分析，爭論蛋白質與蛋白質的相互作用，甚至DNA－蛋白質、RNA－蛋白質的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點等。AnnexinV：是一種檢測細胞凋亡的試劑，在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側。AnnexinV作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。遺傳圖譜〔geneticmap〕：遺傳圖譜又稱連鎖圖譜，通過計算機連鎖的遺傳標志之間的重組頻率，確定他們之間的距離，即以具有遺傳多肽性的遺傳標記為“坐標”，遺傳學距離作為“圖巨”的基因組圖，一般用厘摩〔cM，即每次減數分裂的重組頻率為1%〕來表示.親和層析：是依據生物大分子和配體之間的特異性親和力〔如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等〕，將某種配體連接在載體上作為固定相，而能對與配體特異性結合的生物大分子進展分別的一種層析技術，親和層析是分別生物大分子最為有效的層析技術，具有很高的區分率。基因物理圖譜〔genomephysical〕：通過測定遺傳標志的排列挨次與位置而繪制成的，即以一段核苷酸的DNA片段為“位標”，以DNA〔Mbkb)為“圖距”的基因圖譜。凝膠遷移試驗〔EMSA)：一種爭論DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于爭論DNA結合蛋白，目前已用于爭論RNA結合蛋白和特定的RNA細胞因子〔Cytokines〕：由免疫細胞(如T細胞、B細胞、NK細胞等)和某些非免疫細胞(內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。通過結合相應受體調整細胞生長、分化和效應，調控免疫應答?；蚪M：一個細胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，包括全套基因和間隔序列。癌癥：亦稱惡性腫瘤，為由掌握細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。癌細胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到身體其他局部。高通量測序：：一次性對幾百萬到十億條DNA分子進展并行測序，又稱為下一代測序技術，其使得可對一個物種的轉錄組和基因組進展深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序?；蚪M注釋〔genomeannotation〕：是利用生物信息學方法和工具,對基因組全部基因的生物學功能進展高通量注釋,是當前功能基因組學爭論的一個熱點?；蚪M注釋的爭論內容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面。InnateImmuneResponse〔先天免疫應答〕：是在種系進化和個體發育過程漸漸形成的一系列防范功能，是機體抵擋病原體的第一道防線。與生俱來，作用無針對性，又稱為非特異性免疫應答。cGAMP:環磷酸鳥苷合成酶，由陳志堅教授團隊覺察，是胞外雙鏈DNA的受體其游離與細胞質中參與自然免疫應答。cGAS激活后以AMP與GMP為原料合成cGAMP，cGAMP作為其次信使激活其STING二．論述題簡述雙脫氧測序的原理答：Sanger法測序的原理是利用雙脫氧核苷酸來終止DNA的復制反響。每次測序時由一套四個單獨反響進展，每個反響體系中含有全部四種脫氧核苷酸三磷酸，并混入限量的一種不同的 (ddNTP)。DNA聚合酶在延長DNA的過程中，當摻入每一次序列測定由一套四雙脫氧核苷酸時，由于ddNTP缺少3’-OH不能形成磷酸二酯鍵而終止反響，延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。通過掌握每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度,可使反響得到一組長幾個至千以上個，相差一個堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，電泳凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進展檢測，讀出DNA序列。DeNovo測序DeNovoDeNOVO測序是指在不依靠參考基因組的狀況下對某物種進展基因組測序及拼接組裝，從而繪制該物種的全基因組序列圖譜。基因組測序不僅可以獲得該物種的全基因組序列圖譜，同時也為后續爭論物種起源進化及特定環境適應性奠定根底。依據基因組的簡單程度，基因組可分為：簡潔基因組和簡單基因組。請介紹你對目前二代和三代測序技術的生疏21世紀以來，其次代測序平臺誕生了，與之前的第一代測序技術相比，其次代測序技術一次能夠同時對幾百萬條甚至幾千萬條數據進行測序，因此也稱為高通量測序或者深度測序，是對第一代測序技術的革命性提高。其次代測序技術以及高速度、高通量、低本錢等優點，使人們對于不同物種基因組的探究熱忱高漲。相對于消耗多年時間測序完成的人類基因組打算，使用SOLID技術測序完成一個人的基因組只需要一周左右的時間。但是由于其次代測序技術測出的基因序列較短，給拼接過程帶來了更多的困難，更適用于序列的基因組重測序。其中Roche454Illunima的Solexa用的是合成法測序，ABI的SOLID使用的連接法測序。Roche454測序出的基因片段長度最長，便于開展拼接工作，但是由于其本錢太高，擁有較多基因片段的IllunimaSolexa在拼接中使用的更加廣泛。ABISOLID擁有獨有的雙色球編碼技術，使得每個堿基都會被讀取兩遍，準確率高，因此在檢測SNP、轉錄組測序、ChIP-Seq等方面很有優勢。隨著測序技術的快速進展，速度更快通量更高的第三代測序技術正在逐步完善成熟。相對于前兩代測序技術都需要使用發光或者類發光物質然后就行光學檢測，第三代測序技術主要特點是使用納米技術來實現單分子測序，提高了測序精度。在連續保持高精度測序的根底上，第三代測序技術速度更快并且通量更高。現在的測序技術正朝著更高的通量、更低的本錢、更快速的測序進展。我國也開頭了對第三代測序技術的爭論。2023年12月，中科院北京基因組爭論所與浪潮公司成立了“中科院北京基因組爭論所-浪潮基因組科學聯合試驗室”，聯合各領域科研力氣共同研制國產第三代測序儀。這次合作，是國內IT技術與生命科學的融合。請簡述下比較基因組學對基因組爭論意義比較基因組學是基于基因組圖譜和測序根底上，對的基因和基因組構造進展比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼挨次上和構造上的同源性，克隆人類疾病基因，提醒基因功能和疾病分子機制，說明物種進化關系，及基因組的內在構造；通過對不同親緣關系物種的基因組序列進展比較，鑒定出編碼序列、非編碼調控序列及給定物種獨有的序列；而基因組范圍之內的序列比對，可以了解不同物在核苷酸組成、同線性關系和基因挨次方面的異同，進而得到基因分析推測與定位、生物系統發生進化關系等方面的信息。請論述癌癥爭論中臨床試驗前期的爭論思路及各階段可能的爭論方法爭論思路：試圖在根底爭論與臨床醫療之間建立更直接的聯系。爭論階段：覺察問題：通過比較分析很多成功案例中染色體、蛋白質等的構造差異來覺察問題——免疫染色找到目標：競爭物抑制或比照試驗——凝膠電泳、質譜分析探尋機制：變性雜交、組織培育藥敏法藥物研發：第一代細胞毒性藥物——紫杉醇其次代靶向藥物——CML與費城染色體、BCR-ABL第三代免疫治療臨床試驗：癌癥爭論中的細胞培育——動物模型〔老鼠〕6.請從組織差異性等不同層面闡述癌癥的簡單性組織特異性層面：即那些來自一樣組織用特別治療藥物治療臨床反響可能有深刻影響。因此，人類癌癥基因組景觀的具體分析，與對癌突變如何影響藥物臨床相關具體資料偶聯，依據基因組生物標志物最可能特異性治療有反響的患者，原則上應當能改善臨床有效性。個體間差異性層面：由于個體遺傳基因存在差異性，針對癌癥的治療方法及其效果也因人而異，不同類型的癌癥患者需要選擇適合的藥物。腫癌內部異質性層面：在單個癌癥病人的單個腫瘤內，還存在著不同基因變異來源的腫瘤，是導致癌癥化療與放療復發的重要原因之一。轉錄因子在機體的先天免疫調控中起著重要的作用，請列舉一種轉錄調控因子，解釋其激活與相應的免疫作用分子如干擾素或細胞因子過量表達之間的關系答：核轉錄因子NF-κB是廣泛存在于真核細胞內的重要調整蛋白，是免疫系統機制的活化劑，在 Toll樣受體〔Toll-likereceptors，TLRs〕識別病原相關分子模式后，通過依靠MyD88或TRIF信號傳導通路，轉錄因子NF-κB被誘導激活，從而啟動固有免疫和適應性免疫而抵擋病原的入侵。①功能：1、參與調整基因；2、能夠參與免疫細胞的分化，增殖和活化；3、參與調控一系列重要免疫因子的表達；4、在參與某些細胞的生長調控有及抗細胞凋亡方面亦起著重要作用。②主要分三步：1、NF-kB的誘導劑通過細胞膜激活胞漿中的IκB激酶，使IκBα32、36位絲氨酸的磷酸化，磷酸化的IκB接著被lys21、lys22上被泛素化，泛素化的IκB快速被26S的蛋白酶體降解，NF-κB游離于胞漿中；2、胞漿內游離的NF-κB移位至胞核內，與DNA分子靶基因中啟NF-κB3、啟動靶基因轉錄，生成相應的mRNA。這一過程相當快速，無需蛋白質合成。哺乳動物細胞轉染試驗證明IκKα和IκKβ是NF-κB激活途徑的關鍵酶。假設A病毒是一種雙鏈DNA病毒，在侵染過程中，可以誘導干擾素及細胞因子的釋放，從而引起機體的免疫應答反響。其在宿主體內的持續性感染可以導致機體免疫功能失調，并引起自身免疫系統的疾病。請舉例說明人體有可能通過什么樣的免疫調控機制來應對A病毒的侵染，并就其中的一種可能機制設計出相應的試驗方案來證明你的假設DNA可以做免疫原分子識別病源DNA而激活相應的免疫應答反響的。人體中有外源DNA識別受體cGAS當識別外源DNA時可以激活下游通路產生免疫反響。機制如下：cGAS被激活可以利用AMP與GMP為原料合成cGAMP，cGAMP與其受體STING結合后，STINGIKKTBK1IRF3NF-κB從而入核，激活干擾素等細胞因子的表達。外源DNA→cGAS→cGAMP→STING→IKK與TBK1→IRF3與NF-κB→IFN-β你要一個蛋白質的純化試驗。試驗目的是分別一種參與檸檬酸循環有關的酶--即位于線粒體基質的檸檬酸合酶。請依據以下的步驟答復相應的問題。試驗步驟1：取20kg穎的牛心臟，置于冰上，使用含0.2mol/LpH7.2問題〔1〕為什么要認真臟組織？并且為什么選用如此大量的組織？答：由于三羧酸循環是在線粒體中發生，心肌運動消耗的能量最多，心肌細胞中的線粒體最多。問題〔2〕在整個過程中為什么必需使組織始終保持在低溫？為什pH7.2答：由于酶在低溫環境中不簡潔失活，在PH為7.2時，酶的活性最高。問題〔3〕下一步通過什么試驗手段能夠獲得較純的組織細胞中的線粒體組分？答：制備線粒體承受組織勻漿懸液介質中進展差速離心的方法。問題〔4〕純化的線粒體通過滲透壓裂解后，樣品中含有線粒體膜和線粒體內含物。如何使得蛋白質從樣品中沉淀下來？解釋相應的原理。答：等電點沉淀：在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有一樣電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、分散而產生沉淀，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點時的很多物理性質如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過濾。②鹽析沉淀：蛋白質在水溶液中的溶解度是由蛋白質四周親水基團與水形成水化膜的程度,以及蛋白質分子帶有電荷的狀況打算的.當用中性鹽參加蛋白質溶液,中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質,于是蛋白質分子四周的水化膜層減弱乃至消逝.同時,中性鹽參加蛋白質溶液后,由于離子強度發生轉變,蛋白質外表電荷大量被中和,更加導致蛋白溶解度降低,使蛋白質分子之間聚攏而沉淀.試驗步驟2：沉淀經溶解和透析后，進展相對分子質量排阻層析分別280nm紫外吸取收集各個分別的組分。問題〔5〕為什么使用280nm進展測定？第一個和最終一個組分所含蛋白質的分子特征是什么？答：①蛋白質分子在紫外線280nm波特長具有最大吸取峰。②相對分子質量排阻層析：主要是依據蛋白質的大小和外形，即蛋白質的質量進展分別和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀構造物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進展分別。也叫做分子排阻層析(molecular-exclusionchromatography)。一種利用帶孔凝膠珠作基質，依據分子大小分別蛋白質或其它分子混合物的層析技術。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。試驗步驟3:將上一步收集的組分進展離子交換層析分別。問題〔6〕3答：依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進展分別純化。離子交換層析中的固定相是一些帶電荷的基團，這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。假設流淌相中存在其他帶相反電荷的離子，依據質量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進展交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子。這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流淌相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。試驗步驟4：為了獲得能夠測序〔氨基酸〕的高純度的蛋白質并且進一步進展特征分析，需要使用雙向電泳進展分別純化。問題〔7〕描述雙向電泳的純化原理。答：第一向為等電聚焦，依據蛋白質的等電點不同而將其分別，其次向SDS-，依據其分子量的大小而將其分別。由于其具有大規?？焖俜治龊丸b定蛋白質的力量以及有較好的可重復性和可比性，相對于蛋白質微列矩陣把其稱為蛋白質宏觀矩陣。凝膠過濾和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳這兩種分別蛋白質的方法建筑在分子大小根底上，且兩方法均承受交聯的多聚物作為支持介質，為什么在凝膠過濾時相對分子質量小的蛋白質有較長的停留時間，而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時它又跑的最快？凝膠過濾〔gelfiltration，GF〕，利用某些凝膠對不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進展分別的一門層析技術，其作用機理類似于篩子，小分子蛋白質可以進入更小的多聚物孔隙中，而大分子蛋白質無法進入較小的孔隙，因此是大分子的蛋白質先被洗脫出來，而后是小分子。SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級、三級構造；而強復原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中參加SDS和復原劑后，蛋白質分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與SDS結合后，形成帶負電的蛋白質-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷量，消退了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質-SDS聚合體的外形也根本一樣，這就消退了在電泳過程中分子外形對遷移率的影響。這使得SDS-的遷移率只和蛋白質分子量大小不同有關，相對分子量大的跑的慢而相對分子量小的跑的快。舉例說明酶活單位U/m