基因工程和基因組學第1頁，課件共72頁，創作于2023年2月第一節基因工程(GeneticEngineering)

基因工程概述

限制性內切核酸酶

載體

基因的分離與鑒定

基因工程的應用2第2頁，課件共72頁，創作于2023年2月

基因工程概述★遺傳工程廣義狹義：細胞工程、染色體工程、細胞器工程等基因工程3第3頁，課件共72頁，創作于2023年2月★1、概念：

是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。

基因工程概述也稱為DNA重組技術(DNARecombination)、或分子克隆(Molecularcloning)4第4頁，課件共72頁，創作于2023年2月基因工程的基本操作程序包括：(1)目的基因的分離或合成；(2)用工具酶對目的基因和載體（Vector）進行加工處理，把目的基因與載體結合成重組DNA分子；(3)把重組DNA分子引入受體細胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達；（4）轉化體細胞的擴增；（5）重組體細胞的鑒定與篩選。5第5頁，課件共72頁，創作于2023年2月★2、誕生：

1971年，美國Smith,H.O.

等分離出一種限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；

1972年：Ｂerg,P.

等實現不同酶切DNA片段的體外連接；

1973年：Cohen,s.等將體外重組的DNA

轉入大腸桿菌細胞并得以表達。

基因工程概述6第6頁，課件共72頁，創作于2023年2月1973Cohen第一例成功的克隆實驗1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用第一批轉基因家畜（兔、豬和羊），中國轉基因魚

1993基因工程西紅柿在美國上市1997英國羅斯林研究所多莉羊1999.9中國獲準加入人類基因組計劃.負責測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息生物技術工程：基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程7第7頁，課件共72頁，創作于2023年2月★３、基本過程：

基因工程概述⑴從供體細胞中分離出目的基因；(簡稱“切”)⑵用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子(“接”)；⑶借助細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞(“轉”)；8第8頁，課件共72頁，創作于2023年2月★３、基本過程：

基因工程概述⑷培養轉化細胞，以擴增DNA重組分子，使其整合到受體細胞的基因組中（“增”）；⑸鑒定轉化細胞，獲得外源基因高效表達的細胞（“檢”）；由此可見，基因工程的操作過程可簡化為：“切、接、轉、增、檢”9第9頁，課件共72頁，創作于2023年2月基因克隆示意圖10第10頁，課件共72頁，創作于2023年2月二限制性內切核酸酶

★限制性內切核酸酶或限制性酶：

(restrictionenzymes)

在細菌中此酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。該類能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并將雙鏈DNA分子切斷。11第11頁，課件共72頁，創作于2023年2月工具酶常用的工具酶限制性核酸內切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標記、補平3′末端反轉錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標記末端轉移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基12第12頁，課件共72頁，創作于2023年2月1限制性內切核酸酶

★限制性酶據其作用特點，可分為兩類。

⑴第Ⅰ類限制性酶：每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈

DNA分子，沒有序列特異性。

⑵第Ⅱ類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。其識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種序列稱為回紋對稱序列(palindrome)。13第13頁，課件共72頁，創作于2023年2月14第14頁，課件共72頁，創作于2023年2月15第15頁，課件共72頁，創作于2023年2月16第16頁，課件共72頁，創作于2023年2月17第17頁，課件共72頁，創作于2023年2月2DNA聚合酶DNA聚合酶的主要作用是在體外大量合成目的基因18第18頁，課件共72頁，創作于2023年2月3、DNA連接酶在大腸桿菌和動物細胞中都發現了DNA連接酶，這種酶能夠催化DNA中相鄰的

3’一OH和5’一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。4、逆轉錄酶

RNADNA19第19頁，課件共72頁，創作于2023年2月三載體

一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復制、擴增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。20第20頁，課件共72頁，創作于2023年2月三載體

★作為載體DNA分子，需具備四個條件：⑴具復制原點(ori)，

能攜帶的外源DNA片段獨立地自我復制；⑵具有多克隆位點，即具有多種限制性酶的切點，用于克隆外源DNA片段；⑶至少具有一個選擇標記基因；⑷易從宿主細胞中回收。

21第21頁，課件共72頁，創作于2023年2月1.細菌質粒◆質粒是細菌細胞內獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復制、易分離和導入的環狀雙鏈DNA分子。☆這些質粒的適應范圍廣，拷貝數多。進入宿主細胞復制后，每個細胞的質粒拷貝數可高達1000個。22第22頁，課件共72頁，創作于2023年2月2.λ噬菌體

23第23頁，課件共72頁，創作于2023年2月3.柯斯質粒

24第24頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.穿梭載體

25第25頁，課件共72頁，創作于2023年2月5.細菌人工染色體

26第26頁，課件共72頁，創作于2023年2月6.酵母人工染色體27第27頁，課件共72頁，創作于2023年2月7.Ti質粒及其衍生載體

28第28頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.1目的基因的獲得4.2目的基因和載體的連接4.3重組DNA導入受體菌4.4篩選轉化子4.5克隆基因的表達4重組DNA技術基本原理29第29頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.1目的基因的獲取目的基因的獲取大概有以下途徑：1化學合成法如已知目的基因的核酸序列，則可以利用化學合成法進行人工合成。2基因組DNA可以從基因文庫中篩選出目的基因。30第30頁，課件共72頁，創作于2023年2月3cDNA法通過提取mRNA，然后進行反轉錄得到目的基因。4PCR法用特異的引物，通過聚合酶鏈式反應來擴增目的基因。31第31頁，課件共72頁，創作于2023年2月PCR的基本原理變性、復性、半保留復制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右32第32頁，課件共72頁，創作于2023年2月PCR操作流程90

0C500C700C33第33頁，課件共72頁，創作于2023年2月PCR的三個步驟為一次循環，約需5－10分鐘。每經一次循環，所找到的目的基因擴充一倍。經過20次循環，即可擴增

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倍，總共只需幾個小時。34第34頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.2目的基因和載體的連接外源基因離開染色體是不能復制的。如果將外源基因連到復制子上，外源基因則可作為復制子的一部分進行復制。這種復制子就是載體。載體可分為復制載體和表達載體。表達載體是將外源基因在寄主細胞內表達成蛋白質的載體。作為表達載體必須具有強的啟動子和終止子，而且啟動子必須是受控制的，所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號。35第35頁，課件共72頁，創作于2023年2月選擇了載體后，就要將載體和目的基因在體外進行連接，即DNA的體外重組。DNA的體外重組是依靠連接酶在體外將連接。36第36頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.3重組DNA導入受體菌外源DNA與載體在體外連接成重組的DNA分子后，需要將其導入受體菌。隨著受體菌生長、增殖，重組DNA分子得以復制、擴增、表達。在選擇了適當的受體菌后，經過特殊的方法處理后，使之成為感受態細胞，具備接納外源DNA的能力。感受態的細胞制備有氯化鈣法、電擊發等。37第37頁，課件共72頁，創作于2023年2月38第38頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.4重組體的篩選篩選就是將眾多的轉化菌落和菌斑區分開來，并鑒定那一個菌落或菌斑所含的重組DNA帶有目的基因。39第39頁，課件共72頁，創作于2023年2月篩選的方法有以下種：40第40頁，課件共72頁，創作于2023年2月常用的方法有以下幾種：1遺傳檢測法：如果載體攜帶有某些抗藥性標志基因，轉化后，只有含有這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含有該抗生素的培養板上生存并且形成菌落。抗藥性：以上兩種方法僅僅是初步篩選。插入失活：載體一般含有多克隆位點，在沒有外源DNA插入時該基因可正確表達，當外源基因插入時該基因就不能正確表達。這就是插入失活。41第41頁，課件共72頁，創作于2023年2月2重組質粒的快速提取和酶切鑒定3PCR法如果質粒中重組有外源基因，則可以先快速提取少量質粒進行酶切，然后通過電泳法檢查是否含有目的基因片段。可提取質粒，用特異的引物進行擴增，如能擴增出目的基因片段，則證明目的基因已重組入質粒。42第42頁，課件共72頁，創作于2023年2月4.5克隆基因的表達重組DNA技術的目的是為了擴增目的基因并且使目的基因表達，實現生命科學研究、醫藥或商業目的。克隆基因在受體細胞表達或大量生產涉及正確的基因轉錄、mRNA的翻譯以及后加工等問題。這些過程的進行在不同的表達體系是不一樣的，這些差別不但與基因的來源、性質有關，而且與載體和表達體系有關。43第43頁，課件共72頁，創作于2023年2月常用的表達體系有原核表達體系和真核表達體系。大腸桿菌是當前采用最多的原核表達體系。真核表達體系有酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。44第44頁，課件共72頁，創作于2023年2月45第45頁，課件共72頁，創作于2023年2月46第46頁，課件共72頁，創作于2023年2月47第47頁，課件共72頁，創作于2023年2月48第48頁，課件共72頁，創作于2023年2月49第49頁，課件共72頁，創作于2023年2月五基因工程的應用

(一)基因工程工業(二)植物基因工程(三)轉基因動物(四)遺傳疾病診斷50第50頁，課件共72頁，創作于2023年2月(一)基因工程藥物◆胰島素的人工生產51第51頁，課件共72頁，創作于2023年2月(二)植物基因工程根癌農桿菌介導的植物轉化◆植物基因轉化：是指將外源基因轉移到植物細胞內、并整合到植物基因組中穩定遺傳和表達的過程。◆根癌農桿菌介導的植物轉化52第52頁，課件共72頁，創作于2023年2月2.基因槍轉化技術◆通過高壓氣體等動力，高速發射包裹有重組DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導入受體細胞，并整合到染色體上的方法。◆此法已廣泛用于轉化水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物。53第53頁，課件共72頁，創作于2023年2月(三)轉基因動物

與轉基因植物相比，轉基因動物的發展要慢些。

◆例如，利用轉基因羊大量表達人類的抗胰蛋白酶。◆將人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶產生相關基因啟動子的下游，這種啟動子僅在乳腺細胞中表達，使羊奶中含有大量有功能的人類抗胰蛋白酶；◆可利用家禽作為生物反應器，生產人類大量需要的重要蛋白質。大象的生長基因轉到豬身上54第54頁，課件共72頁，創作于2023年2月(四)遺傳疾病診斷55第55頁，課件共72頁，創作于2023年2月(五)基因治療◆利用基因工程技術，將特異基因導入并整合到具有遺傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病的方法，通常叫做基因治療(genetherapy)。◆目前最常用的方法是利用病毒DNA作載體，構建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組去毒病毒感染患者的細胞，將正常基因整合到染色體上。56第56頁，課件共72頁，創作于2023年2月第二節基因組學

◆基因組學(genomics)：是遺傳學研究進入分子水平后發展起來的一個分支，主要研究生物體全基因組(genome)的分子特征。◆特點：是以基因組為研究單位，而不是以單個基因，◆目標：是認識基因組的結構、功能及進化，弄清基因組包含的全部遺傳信息及相互關系，為最終充分合理利用各種有效資源，預防和治療人類遺傳疾病提供科學依據。57第57頁，課件共72頁，創作于2023年2月58第58頁，課件共72頁，創作于2023年2月㈠構建基因組的遺傳圖譜

(geneticmap)；㈡構建基因組的物理圖譜

(physicalmap)；㈢測定基因組DNA的全部序列；㈣構建基因組的轉錄本圖譜；㈤分析基因組的功能。

基因組學的重要組成部分是基因組計劃(genomeproject)，大體上可分為：59第59頁，課件共72頁，創作于2023年2月◆人類基因組計劃(humangenomeproject，HGP)：◆水稻基因組計劃(ricegenomeproject，RGP)◆模式生物基因組計劃：如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥60第60頁，課件共72頁，創作于2023年2月一基因組圖譜的構建鳥槍射擊法(shotgun)基因組序列測定61第61頁，課件共72頁，創作于2023年2月㈠遺傳圖譜的構建㈡物理圖譜的構建一基因組圖譜的構建

62第62頁，課件共72頁，創作于2023年2月(一)遺傳圖譜的構建

圖譜標記圖譜構建中需要可以鑒別的標記(marker)，在構建遺傳圖譜中，可用基因和DNA作為標記。(1)基因標記

(2)DNA標記63第6