培養基成分與配制第1頁，課件共41頁，創作于2023年2月實質上，對于整株植物生長有重要作用的這15種元素，對于組織培養來說也是必需的。各種常用培養基之間在組分上的主要差別，即在于各種鹽或離子數量上的不同。由質上來看，各種植物組織所需要的無機營養是相當一致的。當無機鹽在水中溶解的時候，它們發生解離，形成離子。培養基中的活性因子即是這些離子，而不是它們的化合物。一種類型的離子可由一種以上的鹽提供。

第2頁，課件共41頁，創作于2023年2月

White培養基是最早的植物組織培養基之一，其中包含了所有必需的營養成分，被廣泛用于根的培養。不過，很多研究者的經驗表明，要想使愈傷組織能令人滿意地生長，這個培養基中的無機成分在數量上是不足的。早期采用的克服這種缺陷的辦法是在培養基中加入某些復雜的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。為了改進合成培養基，后來的研究者通過增加各種無機鹽的濃度，特別是鉀和氮的濃度，成功地取代了那些復雜的混合物。和White培養基比較，在現在廣泛應用的各種培養基中，多數都含有濃度較高的無機鹽。Heller（1953）在其培養基中加入了鋁和鎳，但這兩種元素的必要性并未得到證明，因此已被后來的研究者所省略。鈉、氯化物和碘化物的必要性迄今也還沒有得到證明。

第3頁，課件共41頁，創作于2023年2月

在White（1943）原來的培養基中，鐵是以Fe２(SO４)３的形式加入的，但Street及其合作者在根培養中以FeCI２代替了Fe２(SO４)３，這是因為在Fe２(SO４)３中含有Mn和某些其他金屬離子雜質。然而，FeCI２看來也并不是一個完全令人滿意的鐵鹽。以這種形式存在的鐵只有在PH5.2左右時才能被組織所利用。已知在根培養中，接種后一周之內培養基的PH值即會由原來的4.9～5.0上升到5·8～6.0，于是根開始表現缺鐵癥狀。為了解決這個問題，現在在多數培養基中鐵是以一種螫合形式，即Fe·EDTA（EDTA乙二胺四乙酸）的形式提供的。以這種形式提供的鐵直到PH7.6～8.0仍然可以被植物組織所利用。附帶說一下，與根不同，愈傷組織培養物直到PH為6.0時仍可利用FeCI２，這是因為愈傷組織能分泌自然的鰲合劑，而螫合劑可與鐵相結合。FeEDTA可使用FeSO４·7H2O對和Na2·EDTA進行制備，或者，如果可能的話，從市場上直接購買NaFe·EDTA。

第4頁，課件共41頁，創作于2023年2月在培養基中無機氮的供應可以有兩種形式，一種是硝酸鹽；另一種是銨鹽。當做為唯一的氮源時，硝酸鹽的作用要比銨鹽好得多，但在單獨使用硝酸鹽時，培養基的PH會向堿性方向漂移。若與硝酸鹽一起加入少量銨鹽，則會阻止這種漂移。因此，有好幾種培養基都既含有硝酸鹽，也含有銨鹽。

第5頁，課件共41頁，創作于2023年2月

當某些營養元素的供應不足時，愈傷組織所表現出來的癥狀如下：氮——某些組織（五葉地錦）表現出一種很引人注目的花色素苷的顏色；不能形成導管；氮、鉀或磷——細胞過度生長，形成層組織減退；硫——非常明顯地褪綠；鐵——細胞分裂停止；硼——細胞分裂停滯，細胞伸長；錳或鉬——影響細胞伸長。第6頁，課件共41頁，創作于2023年2月2.有機營養成分(1)含氮物質

大多數培養的細胞都能合成所有必需的維生素，只是數量上顯然不足。為了能使組織很好地生長，在培養基中常常必須補加一種或一種以上的維生素和氨基酸。其中硫胺素（維生素B１）一般認為是一種必需的成分。在其他各種維生素中，已知尤其是吡哆醇（維生素B6），煙酸（維生素B３），泛酸鈣（維生素B５）和肌醇也都能改善培養的植物組織的生長狀況。各種維生素皆溶于水，唯葉酸例外，先要用少量稀氨水溶解，然后加蒸餾水定容。

第7頁，課件共41頁，創作于2023年2月為了促進某些愈傷組織和器官的生長，還常使用很多種化學成分不明的復雜的營養混合物，如水解酪蛋白（CH），椰子汁（CM），玉米胚乳，麥芽浸出物（ME），番茄汁（TJ）和酵母浸出物（YE）等。不過，只要可能，應盡量避免使用這些天然物質。這些物質（特別是果實提取物）在樣品間的差異將會影響實驗結果的可重復性。這是因為，這類提取物所含的生長促進成分的質和量常因組織的年齡和供體植株的品種而變化。此外，只用一種氨基酸也可能有效地取代這些天然物質。第8頁，課件共41頁，創作于2023年2月(2)碳源

Haberlandt（1902）曾試圖培養綠色的葉肉細胞，這可能是出自綠色細胞對營養的要求比較簡單的想法，但這種想法在實驗中并未得到證實。現在我們知道，作為一個規律，起初是綠色的組織在培養中會逐漸失去它們的葉綠素，而只依賴于外界碳源生活。即使是那些在培養期間由于某些突然變化或被置于特殊條件之下而獲得了色素的組織，也不是碳素自養的。如果在培養基中加入一種合適的碳源，就是在培養中已經充分分化了的綠色幼莖也會生長得更好。由此看來，在培養基中加入一種可被利用的碳源是十分必要的。

第9頁，課件共41頁，創作于2023年2月最常用的碳源是蔗糖，濃度一般為2％～5％。已知葡萄糖和果糖也能使某些組織生長得很好，Ball（1953，1955）證實，對于紅杉屬植物（Sequoia）愈傷組織的生長來說，經過高壓滅菌的蔗糖優于過濾滅菌的蔗糖，看來高壓滅菌能使蔗糖水解成為更能被有效利用的糖，如果糖。一般來說，以蔗糖做碳源時，離體的雙子葉植物的根生長得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源時，單子葉植物的根生長得最好。矮生蘋果（Mainspumila，品種Mclntosh）的組織培養物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源時都長得很好。已知植物能夠利用的某些其他形式的碳源有麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。紅杉屬植物和玉米胚乳的組織培養物甚至可以代謝作為唯一碳源的淀粉。

第10頁，課件共41頁，創作于2023年2月3.植物生長物質

除了營養物質以外，為了促進組織和器官的生長，通常還有必要在培養基中加入一種或一種以上的生長調節物質。如生長素、細胞分裂素或赤霉素。第11頁，課件共41頁，創作于2023年2月(1)生長素

在自然界中，生長素影響到莖和節間的伸長、向性、頂端優勢、葉片脫落和生根等現象。在組織培養中，生長素被用于誘導細胞的分裂和根的分化。在組織培養中常用的生長素有：IAA、IBA、NAA.、NOA（萘氧乙酸）、P－CPA（對氯苯氧乙酸）、2,4-D（二氯苯氧乙酸）和2,4,5－T（三氯苯氧乙酸）。其中IBA和NAA廣泛用于生根，并能與細胞分裂素互作促進莖的增殖。2,4-D和2,4，5－T對于愈傷組織的誘導和生長非常有效。生長素一般溶于95％酒精或0.lmol／L的ＮaOH中，以后者的溶解效果更好。第12頁，課件共41頁，創作于2023年2月生長素活性:2,4-D>NAA>IAA2,4-D的活性經IAA高8-12倍,2,4-D在植物體內比較穩定,而IAA極不穩定。第13頁，課件共41頁，創作于2023年2月(2)細胞分裂素

細胞分裂素影響細胞分裂、頂端優勢的變化和莖的分化等。在培養基中加入細胞分裂素的目的，主要是為促進細胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽。由于這類化合物有助于使腋芽由頂端優勢的抑制下解放出來，因此也可用于莖的增殖。比較常用的細胞分裂素有：BAP（芐氨基瞟呤），6－BA（芐基腺瞟呤），2－iP（異戊烯氨基膘呤）和(KT)激動素（呋喃氨基嘌呤）。細胞分裂素一般溶于0.5或lmol／L的HCI或稀的NaOH中。第14頁，課件共41頁，創作于2023年2月細胞分裂素的活性：ZT>BA>KT>腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤>3萬倍.第15頁，課件共41頁，創作于2023年2月(3)赤霉素

赤霉素有20多種，其中在組織培養中所用的是GA３。與生長素和細胞分裂素相比，赤霉素不常使用。據報道，赤霉素能刺激在培養中形成的不定胚正常發育成小植株。赤霉素易溶于冷水，每升水最多可溶解1０００mg。GA３溶于水后不穩定，容易分解，故最好以95％酒精配成母液在冰箱中保存。

第16頁，課件共41頁，創作于2023年2月4.瓊脂

如果使用液體培養基進行靜止培養，組織將會沉沒并因缺氧而死亡。為了避免這種情況，可用瓊脂使培養基凝膠化，然后把組織置于培養基表面。瓊脂是一種由海藻得來的多糖類物質，一般的使用濃度是0.7％～1％，若濃度太高，培養基就會變得很硬，營養物質就難于擴散到培養的組織中去。由于在這種半固體培養基上所建立的培養物便于保存，而且對于多種目的的實驗來說都能得到令人滿意的結果，因此瓊脂固化培養基得到了廣泛的應用。但瓊脂并非是培養基中的一種必需成分。單細胞和細胞聚合體可以在含有無機和有機營養以及激素的液體培養基中進行懸浮培養。不過，在懸浮培養中必須定時通氣，其方法或是由培養基底部鼓入無菌空氣，或是不斷輕輕搖動。在原生質體培養中，如果采用淺層液體培養基或小滴液體培養基進行培養，則可保持靜止，不必通氣。第17頁，課件共41頁，創作于2023年2月

5.PH值在滅菌之前PH值一般都是調節到5.0-6.0之間，一般來說，當PH值高于6時，培養基會變硬，低于5時，瓊脂不能很好地凝固。

6.其他成分

（1）活性炭：在培養基中加入活性炭（AC）主主要是為了吸附植物的有害分泌物，但活性炭對物質吸附的選擇性很低，它同時也吸附某些植物必需的化合物。活性炭的用量一般為0.5%-3%。注意：在高壓滅菌之前加入活性會降低培養基的PH值，合使培養基不易凝固。

第18頁，課件共41頁，創作于2023年2月

（2）硝酸銀：離體培養的植物組織會產生和散發乙烯，而乙烯在培養容器中和積累會影響培養物的生長和分化，AgNO3中的Ag+通過競爭性地結合于細胞膜上的乙烯受體蛋白，從而可起到抑制乙烯活性的作用。培養基中加AgNO3能促進愈傷組織器官發生或體細胞胚胎發生，并能使某些原來再生困難的物種分化出再生植株。AgNO3對于克服試管苗玻璃化及早衰和落葉等也有明顯效果。由于低濃度AgNO3能引起細胞壞死，而這種壞死、細胞會產生一定數量的乙烯，所以AgNO3不一定總能阻止乙烯的積累。AgNO3的使用濃度一般為1—10mg/l。使用過濾滅菌。

第19頁，課件共41頁，創作于2023年2月

（3）抗生素：培養基中添加抗生素的主要目的，是防止由外植體內生菌造成的污染。注意：不同抗生素抑制不同菌種，因此要有針對性選擇抗生素；有時必須幾種抗生素結合使用才能取得較好的效果；抗生素的使用對植物的生長有一定的抑制作用；在停用抗生素后，污染率往往顯著上升。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素等，用量一般為5—20mg/L。大部分要求過濾滅菌。第20頁，課件共41頁，創作于2023年2月二、培養基的種類

長期以來,根據組織培養的不同目的和選用的不同材料,科學工作者們設計了許多不同種類的培養培養基基，最常見的培養基為MS培養基（見表3-1）。MS培養基：Murashige和Skoog于1962年為煙草細胞培養設計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要,因而適用范圍比較廣，多數植物組織培養快速繁殖用它作為培養基的基本培養基。

第21頁，課件共41頁，創作于2023年2月

表3-1MS培養基

大量元素(mg/L)微量元素(mg/L)（NH4NO3）…….1650KI…………….….0.83（KNO3）……….1900H3BO3………..…6.2（CaCI22H2O）….440MnSO44H2O……22.3（MgSO47H2O）...370ZnSO47H2O………8.6（KH2PO4）……..170Na2MoO42H2O….0.25維生素CuSO45H2O…….0.025肌醇……………….100CoCl26H2O……..0.025煙酸……………….0.5FeSO47H2O…….27.8鹽酸硫銨素……….0.1NaEDTA………....37.3鹽酸吡哆素………0.5生長調節物質有機附加物KIN…………...0.0410甘氨酸…………….2.02，4-D…………...1-30蔗糖……………….30g/LpH…5.7第22頁，課件共41頁，創作于2023年2月植物組織培養能否取得成功,營養培養基的種類是一個很關鍵的問題。比較常用的培養基及其成分見表3-2。第23頁，課件共41頁，創作于2023年2月表3-2常用的培養基及其成分第24頁，課件共41頁，創作于2023年2月第25頁，課件共41頁，創作于2023年2月表3-3不同培養基離子濃度的比較第26頁，課件共41頁，創作于2023年2月三、培養基的選擇1.培養基選擇的原則(1)目的性強：要針對不同的培養目的如初代培養、增殖培養、生根培養，分別選擇最適合的培養基;(2)成本低廉：要考慮到工廠化生產時的運營成本，以總體運營效益來評價一種培養基的優劣。

(3)方便可行：試劑容易選購，培養基的制備操作簡單易行。第27頁，課件共41頁，創作于2023年2月2.培養基篩選的方法

(1)選擇基本培養基:

在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養基，一般最好先由一種已被廣泛采用的基本培養基（如MS或B５）開始。第28頁，課件共41頁，創作于2023年2月(2)選擇最佳激素組合:在植物組織培養基中最常改動的因子是生長調節物質，尤其是生長素和細胞分裂素。開始時，可以選擇一種基本培養基，以及不同激素組合，比如說，各有5種不同濃度（0，0.5，2.5，5，10μmol／L）的某種生長素（例如NAA）和某種細胞分裂素（例如BAP）。這兩種激素5種濃度的所有可能組合，即構成了一個具有25項處理的實驗（表3．4）。由這25項處理中選出最好的一個，然后在保持濃度不變的情況下，再試驗其他種類的生長素和細胞分裂素。注意:當改變細胞分裂素的種類時，保持生長素不變，反之亦然。第29頁，課件共41頁，創作于2023年2月表3-4二種激素五種濃度的各種組合第30頁，課件共41頁，創作于2023年2月(3)選擇適宜的鹽分濃度:

高濃度鹽分培養基對若干實驗體系來說都已證明效果很好，但有某些培養物在低濃度鹽分培養基上生長得更好，因此就還有必要試驗一下在保持生長調節物質最佳組合不變的情況下，1／2和1／4水平的基本培養基鹽分的效果。第31頁，課件共41頁，創作于2023年2月(4)確定適宜的蔗糖濃度:

在保持其他成分不變的情況下，設計一個蔗糖濃度梯度（2％～6％以至更高），一篩選出最適宜的蔗糖濃度。通過以上這些實驗，常常就足以研制出一種適合的培養基。不過，為了對這種培養基做進一步的改良還有很多其他可能性值得探討。第32頁，課件共41頁，創作于2023年2月(5)廣譜實驗法:

為了能給一個新的實驗體系選出一種適合的培養基，DeFos-sard等（1974）介紹了一種“廣譜實驗法”。和上面介紹的方法相比，這個方法是比較復雜的。然而，如果利用簡單的方法解決不了問題，就有必要用這個方法試驗一下。

1)在這個廣譜實驗法中，把培養基中的所有組分分為4大類：無機鹽、生長素、細胞分裂素、有機營養物質（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。2)對每一類物質再選定3個濃度，即低（L），中（M）和高（H）（見表3-4）。4類物質各3種濃度的各種不同組合即構成了一項包括81個處理的實驗。3)在這81個處理中最好的一個可用４個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽、低濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高濃度有機營養物質的處理即可表示為MLMH。順序是無機鹽-生長素-細胞分裂素-有機營養。4)達到這個階段以后，即可再試驗不同類型的生長素和細胞分裂素，以找到它們的最好類型。第33頁，課件共41頁，創作于2023年2月表3-5廣譜實驗法中，各類物質的成分和濃度第34頁，課件共41頁，創作于2023年2月四、培養基的制備1.干粉直接配制:

現在配制培養基的最簡單的方法是用市售培養基干粉，其中含有無機鹽、維生素和氨基酸。把這種干粉溶解在蒸餾水里（要比培養基的最終容積少10％），加上蔗糖、瓊脂和其他必要的補加物，最后再加入蒸餾水使之達到最終的容積。調節PH，高壓滅菌，于是制成所需要的培養基。在有些國家有廠家制作和銷售這種干粉培養基，我國市場上目前尚無供應。干粉培養基可用于常規的實驗目的，如植物的快速繁殖等，在這類實驗中所需的培養基成分是早已完全確定了的。在這種情況下，使用干粉培養基就可以節省時間和金錢。第35頁，課件共41頁，創作于2023年2月2.儲備母液配制:

(1)濃縮貯備液的濃縮倍數：

1)大量元素（濃縮20倍）；2)微量元素（濃縮200倍）；3)鐵鹽（濃縮200倍）；

4)除蔗糖之外的有機物質（濃縮200倍）。5)生長調節物質(濃度:mg/ml,分別配制)（2）濃縮貯備液配制方法：以培養及為例，其貯備液的配置如表3-6所示。第36頁，課件共41頁，創作于2023年2月表3-6MS貯備液的配制第37頁，課件共41頁，創作于2023年2月（3）濃縮貯備液配制時注意問題：

1)在制備這4種貯備液的時候，應使每種成分分別溶解，一粒不剩，然后再把它們彼此混合;2)各種生長調節物質的貯備液應當分別配制，如果它們是不溶于水的，則應先把它們溶解在很少量的適當溶劑中（見第3．2.3節），然后再加蒸溜水到最終容積。

3)生長調節物質濃度取決于所要求的生長調節物質的水平，其貯備液的強度可以是１mmol／L，也可以是10mmol／L。

4)所有貯備液都應貯存于適當的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。鐵鹽貯備液須貯存于琥珀色玻璃瓶中，在貯備椰子汁（液體胚乳）的時候，要