酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)介紹第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二6/7/20231主要內(nèi)容第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:關(guān)注蛋白質(zhì)第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:為什么要研究蛋白互作？第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:Clontech分子生物學(xué)工具ClontechMatchmaker?第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二背景介紹:Matchmaker

Gold系統(tǒng)原理ReporterGeneReporterGeneReporterGene第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二主要內(nèi)容第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二基本原理:酵母雙雜交參考文獻(xiàn)Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用第十頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)ADDNA-BDGAL4蛋白具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域BD結(jié)合結(jié)構(gòu)域AD激活結(jié)構(gòu)域第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的分子機(jī)理在GAL4based雙雜交系統(tǒng)中:正常情況在酵母細(xì)胞內(nèi):PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二基本原理:三個(gè)啟動(dòng)子，四個(gè)報(bào)告基因獲得陽(yáng)性克隆子報(bào)告基因表達(dá)AbA抗性篩選Ade營(yíng)養(yǎng)篩選His營(yíng)養(yǎng)篩選X-a-gal藍(lán)白篩選M1G1G2降低假陽(yáng)性！第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二主要內(nèi)容第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二ClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)SMART方法與同源重組技術(shù)結(jié)合構(gòu)建文庫(kù)，聰明的酵母自己做克隆。AbA抗性篩選的添加，有效抑制背景生長(zhǎng)，大大降低假陽(yáng)性。文庫(kù)構(gòu)建于型酵母菌株α型Y187中，方便后續(xù)與a型菌株Y2HGold進(jìn)行mating直接篩選。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗(yàn)證蛋白互作自己構(gòu)建文庫(kù)：630490預(yù)制細(xì)菌文庫(kù)：638802（傳統(tǒng)型）預(yù)制酵母菌文庫(kù)：630480（均一化，通用型）

Clontech蛋白互作相關(guān)試劑盒文庫(kù)篩選文庫(kù)構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)：630489酵母菌轉(zhuǎn)化試劑盒：630439酵母培養(yǎng)基（套裝）：630495插入片段檢測(cè)：630497酵母質(zhì)粒提取：630467體內(nèi)驗(yàn)證：630489630305體外Co-IP驗(yàn)證：630458630459631723631604第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)構(gòu)建:ClontechMM文庫(kù)構(gòu)建方法SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫(kù)分裝，凍存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGG第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫(kù)分裝，凍存1mlmating聰明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重組SMARTcDNA兩小時(shí)構(gòu)建文庫(kù)文庫(kù)構(gòu)建:ClontechMM文庫(kù)構(gòu)建方法第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫(kù)分裝，凍存1mlmatingSD/Leu-文庫(kù)構(gòu)建:ClontechMM文庫(kù)構(gòu)建方法第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)構(gòu)建:ClontechMM自制文庫(kù)篩選SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫(kù)分裝，凍存1mlmatingY187，AD文庫(kù)Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:ClontechMM文庫(kù)篩選630489Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem兩個(gè)載體兩個(gè)菌株轉(zhuǎn)化試劑盒control630489Y187Y2HGold三個(gè)載體陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439極大提高轉(zhuǎn)化率可以單獨(dú)購(gòu)買第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:ClontechMM系統(tǒng)質(zhì)粒誘餌載體InY2HGold第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:誘餌載體構(gòu)建及其自激活檢測(cè)Y2HGold誘餌載體第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:Mating方法篩選Y187α型DDO篩選二倍體Y2HGolda

型Mating接合反應(yīng)

酵母的有性生殖過(guò)程，Clontech利用這個(gè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了文庫(kù)篩選。

ADBDMixMatingQDO篩選第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:均一化通用文庫(kù)篩選均一化通用型文庫(kù)高豐度與低豐度均衡大大降低工作量大大降低假陽(yáng)性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187，AD文庫(kù)Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:傳統(tǒng)細(xì)菌文庫(kù)篩選文庫(kù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀釋，150ul/板進(jìn)行涂板，過(guò)夜培養(yǎng)。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y187，獲得酵母文庫(kù)。Mating篩選將文庫(kù)與誘餌培養(yǎng)液混合，進(jìn)行Mating。涂篩選板，挑取陽(yáng)性克隆子。刮取平板上的菌落，提取質(zhì)粒。第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子（PCR確認(rèn)）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker?InsertCheckPCRMix2第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二文庫(kù)篩選:酵母質(zhì)粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二驗(yàn)證互作:體內(nèi)驗(yàn)證SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二驗(yàn)證互作:體外Co-IP驗(yàn)證BaitAcGFP1PLPreyProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）

第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二驗(yàn)證互作:體外Co-IP驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程PL檢測(cè)第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二驗(yàn)證互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-Vector第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二ClontechMatchmaker系統(tǒng)產(chǎn)品選擇指南第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1

TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiol

ClontechMatchmaker系統(tǒng)近期參考文獻(xiàn)第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二主要內(nèi)容第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二常見(jiàn)問(wèn)題分析:酵母雙雜交文庫(kù)如何獲得？購(gòu)買Clontech公司預(yù)制文庫(kù)用630490自己構(gòu)建文庫(kù)請(qǐng)Takara公司提供文庫(kù)構(gòu)建服務(wù)如何獲得酵母雙雜交文庫(kù)第三十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期二常見(jiàn)問(wèn)題分析:一定要做自激活檢測(cè)嗎？必須滴！自激活檢測(cè)必須做：1.需要在Y2HGold菌株中進(jìn)行。2.如果出現(xiàn)自激活現(xiàn)象需要調(diào)整AbA濃度或者調(diào)整序列。3.如果菌落生長(zhǎng)過(guò)慢，可能是表達(dá)有毒性，需要用低