酵母雙雜交系統(tǒng)技術介紹第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二6/7/20231主要內容第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:關注蛋白質第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:為什么要研究蛋白互作？第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:Clontech分子生物學工具ClontechMatchmaker?第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二背景介紹:Matchmaker

Gold系統(tǒng)原理ReporterGeneReporterGeneReporterGene第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二主要內容第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二基本原理:酵母雙雜交參考文獻Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二基本原理:GAL4轉錄因子的結構ADDNA-BDGAL4蛋白具有兩個功能結構域BD結合結構域AD激活結構域第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二基本原理:GAL4轉錄因子的分子機理在GAL4based雙雜交系統(tǒng)中:正常情況在酵母細胞內:PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二基本原理:三個啟動子，四個報告基因獲得陽性克隆子報告基因表達AbA抗性篩選Ade營養(yǎng)篩選His營養(yǎng)篩選X-a-gal藍白篩選M1G1G2降低假陽性！第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二主要內容第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二ClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點SMART方法與同源重組技術結合構建文庫，聰明的酵母自己做克隆。AbA抗性篩選的添加，有效抑制背景生長，大大降低假陽性。文庫構建于型酵母菌株α型Y187中，方便后續(xù)與a型菌株Y2HGold進行mating直接篩選。第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗證蛋白互作自己構建文庫：630490預制細菌文庫：638802（傳統(tǒng)型）預制酵母菌文庫：630480（均一化，通用型）

Clontech蛋白互作相關試劑盒文庫篩選文庫構建酵母雙雜交系統(tǒng)：630489酵母菌轉化試劑盒：630439酵母培養(yǎng)基（套裝）：630495插入片段檢測：630497酵母質粒提取：630467體內驗證：630489630305體外Co-IP驗證：630458630459631723631604第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫構建:ClontechMM文庫構建方法SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGG第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmating聰明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重組SMARTcDNA兩小時構建文庫文庫構建:ClontechMM文庫構建方法第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingSD/Leu-文庫構建:ClontechMM文庫構建方法第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫構建:ClontechMM自制文庫篩選SMART合成cDNA共轉化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:ClontechMM文庫篩選630489Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem兩個載體兩個菌株轉化試劑盒control630489Y187Y2HGold三個載體陽性對照，陰性對照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439極大提高轉化率可以單獨購買第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:ClontechMM系統(tǒng)質粒誘餌載體InY2HGold第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:誘餌載體構建及其自激活檢測Y2HGold誘餌載體第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:Mating方法篩選Y187α型DDO篩選二倍體Y2HGolda

型Mating接合反應

酵母的有性生殖過程，Clontech利用這個過程，實現了文庫篩選。

ADBDMixMatingQDO篩選第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:均一化通用文庫篩選均一化通用型文庫高豐度與低豐度均衡大大降低工作量大大降低假陽性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:傳統(tǒng)細菌文庫篩選文庫培養(yǎng)提取質粒轉化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀釋，150ul/板進行涂板，過夜培養(yǎng)。將提取的質粒轉化Y187，獲得酵母文庫。Mating篩選將文庫與誘餌培養(yǎng)液混合，進行Mating。涂篩選板，挑取陽性克隆子。刮取平板上的菌落，提取質粒。第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:驗證陽性克隆子（PCR確認）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker?InsertCheckPCRMix2第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選:酵母質粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二驗證互作:體內驗證SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2第二十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二驗證互作:體外Co-IP驗證BaitAcGFP1PLPreyProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）

第三十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二驗證互作:體外Co-IP驗證實驗流程PL檢測第三十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二驗證互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-Vector第三十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二ClontechMatchmaker系統(tǒng)產品選擇指南第三十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1

TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiol

ClontechMatchmaker系統(tǒng)近期參考文獻第三十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二主要內容第三十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二常見問題分析:酵母雙雜交文庫如何獲得？購買Clontech公司預制文庫用630490自己構建文庫請Takara公司提供文庫構建服務如何獲得酵母雙雜交文庫第三十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二常見問題分析:一定要做自激活檢測嗎？必須滴！自激活檢測必須做：1.需要在Y2HGold菌株中進行。2.如果出現自激活現象需要調整AbA濃度或者調整序列。3.如果菌落生長過慢，可能是表達有毒性，需要用低