------------------------------------------------------------------------《培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌》實驗報告《培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌》實驗報告實驗目的1.學習和掌握配制培養(yǎng)基（以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制為例）的一般方法和原理。2.了解消毒和滅菌的原理，掌握常用滅菌方法的操作步驟。實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中．微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對PH要求不一樣．雷菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細菌和嗜酸細菌例外)。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌．如果來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥．繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能道出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供作微生物生長繁殖之用。基礎培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96℃時溶化，實際應用時，一般在沸水浴中或下而墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此要用稀酸或稀堿將其PH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4—7.6實驗儀器與藥品1.溶液或試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol／LNaOH、1mol／LHCl。2.儀器或其他用具：試管、三角瓶、1000ml燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH5.5-9.0）、普通棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布等。實驗步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備1.稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。2.溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。3.調pH在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸．用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol／LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其PH，直至pH達7.4-7.6。反之，用1mol／LHCl進行調節(jié)。4.過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結果的觀察?？梢允∪?本實驗勿需過濾)。5.分裝液體分裝分裝高度以試管高度的1／4左右為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。半固體分裝一般以試管高度的1／3為宜，滅菌后垂直待凝。6.加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內面造成污染，并保證有良好的通氣性能(棉塞制作方法附本實驗后面)。7.包扎加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。8.滅菌將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，l21℃9.擺斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃l0.無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37℃注意事項1.蛋白胨很容易吸濕，在稱取時動作要迅速，另外，稱量時嚴防藥品混雜．一把牛角匙用于一種藥品．或稱取一種藥品后，洗凈——擦干——再稱職另一藥品——瓶蓋也不要蓋錯。2.在瓊脂溶化過程中．應控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長。3.對于有些要求PH較精確的微生物，其PH的調節(jié)可用酸度計進行(使用方法、可參考有關說明書)。pH不要調過頭，以避免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時．若預先記好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。4.分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。（二）高壓蒸汽滅菌法步驟1.加水使用前在鍋內加入適量的水，加水不可過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。水面與三角架相平為宜2.裝料將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。3.加蓋蓋好鍋蓋，按對稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣閥。4.加熱排氣加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時，排出的氣流很強并有噓聲時，維持2—3min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應適當延長排氣時間，務必使空氣充分排除，然后將排氣閥關閉。5.加壓將排氣閥關閉6.保壓當壓力升至0.1MPa時，溫度達121℃，此時應注意觀察，控制熱源。保持壓力穩(wěn)定，維持20-30min7.自然降壓當壓力表降至“0”處，稍停，使溫度繼續(xù)降至100℃以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋，取出滅菌物。注意：切勿在鍋內壓力尚在“0”點以上，溫度也在100℃以上時開啟排氣閥，否則會因壓力驟然降低，而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培養(yǎng)時引起雜菌污染。壓力降到“08.保養(yǎng)滅菌完畢取出物品后，將鍋內余水倒出，以保持內壁及內膽干燥，蓋好鍋蓋。9.培養(yǎng)基無菌檢查五、關鍵步驟及注意事項

1.要嚴格按配方配制。

2.調pH不要過頭。

3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC以下放物、取物。

4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。

5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗