發酵工業微生物菌種制備與培養基第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二：工業化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養基，大量高效地合成產物有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強遺傳性能要相對穩定不易感染它種微生物或噬菌體產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）生產特性要符合工藝要求第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

由于發酵工程本身的發展以及遺傳工程的介入，藻類（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地變為工業生產用的生物。

盡管如此，目前人們對微生物的認識還是十分不夠的。已經初步研究的不超過自然界微生物總量的10%左右。

微生物的代謝產物據統計已超過一千三百多種，而大規模生產的不超過一百多種；

微生物酶有近千種，而在工業上利用的不過四五十種。可見潛力是很大的。

在工業生產中常用的微生物主要有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌。三、工業生產常用的微生物第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、細菌（bacteria）：可粗分為6種類型，即細菌（狹義）、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體和衣原體。是一類形狀細短，結構簡單，多以二分裂方式進行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個體數量最多的有機體，是大自然物質循環的主要參與者。根據形狀分為三類，即：球菌、桿菌和螺形菌。按細菌的生活方式來分類，分為兩大類：自養菌和異養菌，其中異養菌包括腐生菌和寄生菌。按細菌對氧氣的需求來分類，可分為需氧（完全需氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細菌。

第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五工業生產常用的細菌有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

乳酸桿菌(Lactobacilluslactics)

醋酸桿菌(Acetobacter)

棒狀桿菌(Corynebacterium)

短桿菌(Brevibacterium)

用于生產：生產淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lacticacid)

醋酸(aceticacid)

氨基酸(aminoacid)

肌苷酸(inosinicacid)

第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

2、酵母菌（yeast）

酵母菌為單細胞真核生物（unicellulareukaryote），在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質較多的的酸性環境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（petroleumyeast）較多地分布在油田周圍的土壤中。

酵母菌大多為腐生，常以單個細胞存在，以發芽形式進行繁殖。母細胞體積長到一定程度時就開始發芽。芽長大的同時母細胞縮小，在母子細胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母細胞。如果子芽不與母細胞脫離就形成鏈狀細胞，稱為假菌絲(pseudomycelium)。

工業上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candida)、類酵母(Saccharomycodes)等，用于釀酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固點石油、生產脂肪酶（lipase），以及生產可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

3、

霉菌（mould）

霉菌不是一個分類學上的名詞。凡生長在營養基質上形成絨毛狀、網狀或絮狀菌絲的真菌(fungi)統稱為霉菌。霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土壤、空氣、水和生物體內外等處。它喜歡偏酸性環境，大多數為好氧性(aerobiotic)，多腐生，少數寄生。霉菌的繁殖能力很強，它以無性孢子和有性孢子進行繁殖，大多以無性孢子繁殖為主。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

生長方式是菌絲末端的伸長和頂端分支，彼此交錯呈網狀。菌絲的長度既受遺傳性的控制，又受環境的影響，其分支數量取決于環境條件。菌絲或呈分散生長，或呈菌絲團狀生長。工業上常用的霉菌有：藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等；產品：酶制劑（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有機酸（organicacid）及甾體激素（steroidhormone）等。第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

4、放線菌(Actinomycetes)

放線菌因菌落呈防線狀而得名。它是一個原核生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在含有機質豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數寄生。放線菌主要以無性孢子進行繁殖，也可借菌絲片段進行繁殖。后一種繁殖方式見于液體沉浸培養（submergedcultures）中。其生長方式是菌絲末端伸長和分支，彼此交錯成網狀結構，成為菌絲體。菌絲長度既受遺傳性的控制，又與環境相關。

第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五在液體沉浸培養中由于攪拌器（agitator）的作用，常常形成短的分支旺盛的菌絲體，或呈分散生長，或呈菌絲團狀生長。它的最大經濟價值在于能產生多種抗生素（antibiotics）。從微生物中發現的抗生素，有60%以上是放線菌產生的，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。常用的放線菌主要來自以下幾個屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

5、擔子菌（Basidiomycetes）：所謂的擔子菌就是人們通常所說的菇類(mushroom)生物。擔子菌資源的利用正愈來愈引起人們的重視，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)藥物的開發。近幾年來，日本、美國的一些科學家對香菇的抗癌作用進行了深入的研究，發現香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質具有抗癌作用。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

6、藻類（alga）：培養螺旋藻，按干重計算每公頃可收獲60噸，而種植大豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質產率來看，螺旋藻是大豆28倍。培養珊列藻，從蛋白質產率計算，每公頃珊列藻所得蛋白質是小麥的20-35倍。此外，還可通過藻類將CO２轉變為石油，培養單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細胞干重得5%-50%,合成的油與重油相同，加工后可轉變汽油、煤油、和其他產品。有的國家已建立培植單胞藻的農場，每年每公頃地培植的單胞藻暗5%干物質為碳水化合物（石油）計算，可得60噸石油燃料。此項技術的應用，還可減輕因工業生產而大量排放CO２造成的溫室效應。國外還有人從“藻類農場”獲取氫能的報道，大量培養藻類，利用其光合放氫作用來取得氫能。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第二節

菌種的衰退、復壯與保藏

一、微生物菌種衰退的原因

1、原因一是菌種保藏不妥;

二是菌種生長的要求沒有得到滿足，或是遇到不利的條件，或是失去某些需要的條件；三是經誘變獲得的新菌株發生回復突變，從而喪失新的特征的情況。連續傳代是菌種退化的直接原因。衰退菌株的特點：個體或群體特征發生變化；生產能力降低；代謝能力降低；發酵周期延長；抗不良環境能力降低。

第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

2、防止菌種衰退的措施菌種的分離:。對于已衰退的菌株采用單細胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得單細胞所長成的菌落（colony），再通過菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來形狀的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。

如果菌種已經發生退化，產量下降，則要進行分離復壯。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五如對芽孢桿菌(Bacillus)，可先將菌液用沸水處理幾分鐘，再用平板進行分離，從所剩下的孢子中挑選出最優的菌體。某些菌株即使進行單細胞分離，仍不能達到復壯的效果，則可改變培養條件，達到復壯的目的。

如AT3.942棲土曲霉(Aspergillusterricola)的產孢子能力下降，可適當提高培養溫度，恢復其能力。同時通過實驗選擇一種有利于高產菌株而不利于低產菌株的培養條件。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二菌種的復壯通過分離達到復壯:

在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊脂培養基混合培養再分離，達到菌落純采用單細胞或單孢子分離法達到細胞純通過寄主體達到復壯:

將菌株接種到寄主細胞進行繁殖達到復壯。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三

菌種保藏（strainpreservation）

基本原理：根據菌種的生理、生化特點，人工地創造條件，使菌種的代謝活動處于不活波狀態。要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡量使菌種保持原來優良的生產性能。保藏時首先選擇優良純菌種，最好是它們的休眠體如孢子（spore）、芽孢(gemma)等；其次是要創造一個有利于休眠的環境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養物質的，即可達到降低其代謝活動，延長其保存期的目的。

第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五保存方法：

應能較長期地保存原有菌種的優良性能，使菌種穩定，同時也要考慮到方法本身的經濟簡便。不同的菌種有不同的保存方法，以便長期保藏。酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保藏法。霉菌：沙土管保藏法。細菌和放線菌：一般細菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。

保藏應注意的問題：

菌體狀態：休眠體基質：營養貧乏操作過程：不應對細胞造成傷害第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第三節菌株選育目的提高生產能力提高產品質量開發新產品解決生產實際問題防止菌種退化第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五自然狀態下，發生自然突變的機率為10-8-10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。一、自然選育第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態的觀察)發酵試驗第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五原種（出發菌株）純化斜面培養完全培養基同步培養離心洗滌玻璃珠震蕩分散過濾單細胞或孢子懸浮液

自然分離（對照液）活菌計數誘變處理誘變處理預備實驗

處理液活菌計數平板分離

形態變異并計算其變異率斜面培養

初篩、復篩

自然分離和再復篩

保藏及擴大試驗誘變育種第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

第四節種子擴大培養

一、種子擴大培養的任務1、提供相當數量的代謝旺盛的種子。接種量大，發酵時間則短。

2、得到純而壯的培養物，還要獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養物。

不同產品的發酵，決定種子擴大培養的級數。第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

第五節培養基及其制備

培養基是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的、按一定比例配制的的多種營養物質的混合物。培養基組成對菌體生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離精致、產品的質量和產量都有重要的影響。微生物的營養活動，是依靠向外界分泌大量的酶，將周圍環境中大分子的蛋白質、糖類、脂肪等營養物質分解成小分子化合物，在借助于細胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營養來實現的。第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

一、培養基的類型和用途天然培養基化學成分不清楚或化學成分不恒定的各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質（例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）合成培養基:

使用化學成分和數量完全了解的物質配制而成的。使用于實驗室范圍作有關營養、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析定量研究工作。半合成培養基：既含有天然成分又含有純化學試劑的培養基。第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（生物）鑒別培養基：培養基中加入能與某一菌的無色代謝物發生顯色反應的指示劑，從而用肉眼區別于該菌與其他菌。

選擇培養基：根據某種微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基。

固體培養基：外觀呈固體的培養基。半固體培養基：凝固劑量低于正常量液體培養基：呈液體狀態的培養基。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

孢子培養基：供制備孢子用的培養基。基質濃度（有機氮）要低些，否則影響孢子的的形成。無機鹽要適量，否則影響孢子的數量和質量。常用的有麩皮、大（小）米，無機鹽、蛋白胨等配制的瓊脂斜面培養基。

種子培養基：供孢子發芽和菌體生長用的培養基。為使培養的種子能較快適應發酵罐內的環境，在設計種子培養基時要考慮與發酵培養基組成的內在聯系。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五發酵培養基：

供菌體生長和合成大量代謝產物用的培養基。不同的菌體，不同的產品，對培養基的要求是不同的。不同的發酵產品，培養基的狀態、粘度、各成分的含量也是不同的。但是，基本的營養需求是一致。因此，應根據不同的情況選擇發酵培養基。第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

二、發酵培養基選擇的應遵循的原則：

1、提供合成微生物細胞和發酵產物的基本成分.2、有利于提高培養基中產物的濃度，以提高單位容積發酵罐的生產能力。

3、有利于提高產物的合成速度，縮短發酵周期.

第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4、盡量減少副產物的形成，便于產物的分離純化5、原料價格低廉，質量穩定，取材容易。6、所用原料盡可能減少對發酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率降低能耗。有利于產品的分離和純化，并盡可能減少產生“三廢”的物質。另外，要考慮配比、滲透壓、PH、氧化還原等因素。第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

碳源：供給菌體生命活動所需的能量和構成菌體細胞以及代謝產物的基礎。有糖類、脂肪、某些有機酸等等。氮源：主要構成菌體細胞物質和代謝產物，可分為有機氮源和無機氮源。功能：構成菌體成分；作為酶的組成分或維持酶的活性；調節滲透壓、PH值、氧化還原電位等。

第二節工業發酵培養基第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五無機鹽：鈣、鎂、硫、磷、鉀、鈉、氯、鋅、鈷、錳。特殊生長因子：其功能是構成輔酶的組成分，促進生命活動的進行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是極少的。水：體內各種生化作用必須在水溶液中進行。營養物質必須溶解于水中，才能透過細胞膜被微生物利用。誘導劑、前體和促進劑：胞外酶合成需要誘導物。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五不同的發酵產物，不同的菌種所選擇的發酵培養基是不同的。白酒(chinesespirit)發酵：固體發酵培養基；果酒(fruitspirit)發酵：fruitjuiceorfruitsauce；啤酒(beer)發酵：麥芽汁(wort)液體培養基；酒精(alcohol)發酵：淀粉糖化醪(starchmash)；氨基酸(aminoacid)發酵：水解糖液加其他營養成分；檸檬酸(citricacid)發酵：淀粉液化醪(starchdextrinizatemash)；乳酸(lacticacid)發酵：淀粉糖化醪(starchmash)；甲烷(methane)發酵：復雜的有機廢物發酵；抗生素(antibiotic)發酵：淀粉糖化醪(starchmash)+豆餅粉+麩皮粉；第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五一、工業常用的碳源葡萄糖：純葡萄糖、水解淀粉乳糖：純乳糖、乳清粉淀粉：大麥、花生粉、燕麥粉、黑麥粉蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖醋酸、乙醇、亞硫酸紙漿廢液、食品工廠的下腳等等。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

糖蜜中主要含有蔗糖，總糖含量可達50%~70%。糖蜜分為甘蔗糖蜜(canemolasses)和甜菜糖蜜(beetmolasses)，二者在糖的含量和無機鹽的含量都有所不同，使用時應注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生產中，抗生素等微生物工業也常用它作為碳源。酒精工業中若用糖蜜代甘薯粉，則可省去蒸煮、制曲、糖化等過程，簡化了酒精生產